利用假病毒系统开发德宏病毒（DEHV）中和试验及生物发光成像小鼠模型：开启病毒研究新征程

时间：2025年4月3日

来源：Microbiology Spectrum

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本文开发了德宏病毒（DEHV）的体外中和试验和基于假病毒系统的体内生物发光成像小鼠模型。证实 DEHV 利用 NPC1 受体进入细胞，且其抗血清对孟拉病毒和马尔堡病毒（MARV）无中和活性，为研究 DEHV 生物学及评估治疗干预提供了重要平台。

### 引言
丝状病毒科（Filoviridae）包含能在灵长类动物中引发急性出血热的病原体，埃博拉病毒和马尔堡病毒（MARV）最为人熟知，致死率高。近年来，新的丝状病毒不断被发现，如 2018 年在塞拉利昂发现的邦巴利病毒，2019 年和 2023 年在中国云南发现的孟拉病毒（MLAV）和德宏病毒（DEHV）。

DEHV 基因组是丝状病毒科中最大的，编码七种蛋白质，与 MARV 和 MLAV 遗传特征相似，且利用尼曼 - 皮克病 C1 型（NPC1）受体进入细胞。尽管目前未发现人类感染病例，但需深入研究其致病性、毒力及跨物种传播风险。本研究构建基于人类免疫缺陷病毒（HIV）的假病毒系统，开发体外中和试验和体内生物发光成像小鼠模型，探究 DEHV 感染机制、致病性及潜在治疗方法和疫苗。

结果

体外中和试验的建立与优化：用含 HIV 骨架和 DEHV 全长糖蛋白（GP）的质粒共转染 HEK293T 细胞，获得 DEHV 假病毒，通过测量相对荧光值确定其滴度。多种细胞系支持假病毒感染，HEK293T 细胞发光值最高，适合检测中和抗体。确定了细胞接种密度（20,000 - 40,000 个细胞 / 孔）、检测时间点（感染后 60 小时）和假病毒剂量（40,000 - 80,000 TCID₅₀/mL）的最佳条件，且该试验特异性良好。
生物发光成像小鼠模型的构建与优化：评估不同病毒接种方法，腹腔注射因信号强、操作简单被选用。4 周龄 BALB/c 小鼠对 DEHV 假病毒易感性高，感染后 2 天可检测到生物发光信号，5 天达到峰值，8 天下降，4 - 7 天为最佳分析窗口。病理分析显示假病毒不引起组织损伤。
NPC1 在 DEHV 细胞进入中的作用：利用 Cas9 技术构建 NPC1 基因敲除（NPC1 - KO）的 HEK293T 细胞，验证敲除成功。DEHV 假病毒无法感染 NPC1 - KO 细胞，而过表达人源 NPC1（hNPC1）可恢复感染能力，证实 NPC1 是 DEHV 进入细胞的受体。构建不同宿主 NPC1 表达质粒，发现 DEHV 假病毒利用不同物种 NPC1 进入细胞的效率相似。
免疫策略及交叉保护研究：测试多种免疫策略，发现假病毒免疫产生的中和抗体滴度最高。制备 MARV 和 MLAV 假病毒进行中和试验，结果表明 DEHV 抗血清对这两种病毒无中和活性。

讨论

丝状病毒科新成员不断涌现，尽管部分病毒未引发人类感染，但存在跨物种传播风险。DEHV 假病毒的开发为研究其感染机制、评估抗病毒药物和疫苗提供了平台。研究发现 NPC1 是 DEHV 入侵的关键受体，部分物种 NPC1 突变未影响 DEHV 入侵，其机制有待进一步研究。不同细胞类型中 NPC1 表达水平与假病毒感染效率存在差异，DEHV - GP 在不同细胞中的裂解效率也不清楚。

DEHV 抗血清不能中和 MARV 和 MLAV，反之是否成立需进一步研究。三剂 DEHV 假病毒免疫策略产生最高中和滴度，其免疫增强机制需深入探索。本研究模型存在局限性，假病毒模型只能研究病毒进入机制，生物发光成像模型需考虑动物皮毛和器官位置对结果的影响。但这些模型为研究预防措施和早期干预提供了实用平台。

材料和方法

细胞：使用多种细胞系，包括 HEK293T、HeLa 等。用 CRISPR - Cas9 技术构建 HEK293T - NPC1 - KO 细胞，通过转染 pIRES2 - EGFP - NPC1 质粒构建 NPC1 过表达细胞系。
质粒：构建八种物种的 NPC1 蛋白表达质粒，将 DEHV、MARV 和 MLAV 的 GP 基因克隆到真核表达载体 pcDNA3.1 中，使用实验室保存的 pSG3.Δenv.cmv.Fluc 质粒。
定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）：对假病毒进行离心、提取 RNA、逆转录为 cDNA，进行 qRT - PCR 检测，通过标准曲线反映假病毒中 GP 的表达水平。
动物实验：动物实验经相关委员会批准，用不同年龄和品系的小鼠感染 DEHV 假病毒，监测生物发光信号。对 4 周龄 BALB/c 小鼠进行免疫并采血。
生物发光成像：给小鼠注射 D - 荧光素，麻醉后用成像系统检测发光值，对小鼠组织进行染色分析。
假型病毒和中和试验：共转染细胞制备假病毒，进行假病毒滴定和中和试验，计算 50% 组织培养感染剂量（TCID₅₀）和 50% 抑制稀释度（ID₅₀）。
蛋白质免疫印迹（Western blotting）：转染细胞和收集假病毒后制备样本，进行电泳、转膜，用相应抗体孵育检测。
流式细胞术：对转染不同物种 NPC1 的细胞进行处理，制备单细胞悬液，用流式细胞仪分析。
统计分析：使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析，结果以均值 ± 标准误表示，通过双尾 Student's t 检验判断差异显著性。