引言
多巴胺（Dopamine，DA）作为一种高价值代谢产物，在神经生理活动中发挥着关键作用，比如参与学习和动机等过程 ，同时也是去甲肾上腺素和肾上腺素的前体，在调节身体多种生理功能方面意义重大，临床上常被用于治疗各类休克 。在特定条件下，DA 还能氧化自聚形成聚多巴胺（Polydopamine，PDA），在生物材料领域应用广泛 。然而，目前 DA 的合成主要依赖化学方法，存在工艺复杂、原料昂贵且有毒等问题，因此，开发可持续、安全且经济高效的 DA 合成方法迫在眉睫。
在 DA 的生物合成过程中，酪氨酸（Tyrosine，Tyr）通常作为底物，先被羟基化形成 L - 多巴（L-DOPA），随后再经过脱羧反应生成 DA。4 - 羟基苯乙酸 3 - 单加氧酶（由 hpaBC 基因编码）由单加氧酶 HpaB 和黄素还原酶 HpaC 组成，HpaB 能催化大肠杆菌中 4-HPA 类似物（酚、对甲酚和 Tyr）的邻位羟基化，而 HpaC 作为偶联因子，为 HpaB 的羟基化反应提供 FADH2 。近年来，研究发现 5'- 磷酸吡哆醛依赖的多巴胺脱羧酶（Dopamine decarboxylase，DDC，EC 4.1.1.28）可催化 L-DOPA 转化为 DA 。虽然已有不少关于 DA 生物合成的探索，但由于 DA 生物合成途径涉及复杂的代谢通量分布和发酵条件，目前大规模工业生产 DA 仍面临诸多挑战，比如大肠杆菌代谢途径分支多导致碳源大量流失、DA 代谢途径存在多个反馈抑制位点、发酵过程中辅助因子（FADH2和 NADH）难以有效补充以及 DA 易被氧化等问题。所以，改进现有改造方法、构建高产 DA 菌株十分必要。
结果
- 大肠杆菌中 DA 的初步合成：本研究选用遗传背景清晰、代谢特性易于调控的大肠杆菌 W3110 作为底盘菌株。考虑到在大肠杆菌中，酪胺氧化酶（Tyramine oxidase，TynA）会将 DA 氧化为 3,4 - 二羟基苯乙醛，为促进 DA 积累，首先敲除了 W3110 中的 tynA 基因，并在 LacI 位点整合由木糖启动子驱动的 T7 RNA 聚合酶基因，得到菌株 DA-1。接着，为了合成中间产物 L-DOPA，将来自大肠杆菌 BL21 (DE3) 的 hpaBC 基因导入 DA-1 菌株，利用乳糖启动子控制相关基因表达，获得菌株 DA-1–1。
为提升该菌株合成 DA 的能力，研究人员筛选了 5 种高效的 DDC 基因，分别是来自异色瓢虫（Harmonia axyridis）的 HaDdc 、家猪（Sus scrofa）的 SsDdc 、人类（Homo sapiens）的 HsDdc 、栉孔扇贝（Chlamys farreri）的 CfDdc 以及黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的 DmDdc 。将这 5 种基因分别整合到 DA-1–1 菌株中，用乳糖启动子控制表达，得到 5 种重组菌株。向这 5 种重组菌株中添加 Tyr 进行摇瓶发酵 24 小时后，对 DA 产量进行定量分析。结果显示，导入 hpaBC 基因后，DA-1–1 菌株中出现了 L-DOPA，产量为 0.94 g/L。同时发现，表达不同脱羧酶的菌株在 DA 产量上存在显著差异，5 种菌株的 DA 产量分别为 0.51 g/L、0.62 g/L、0.32 g/L、0.47 g/L 和 0.77 g/L，其中含有来自黑腹果蝇 DmDdc 基因的 DA-6 菌株 DA 产量最高。
2. 关键酶启动子的优化：启动子作为顺式调控元件，对基因表达起着关键的调控作用，其强度直接影响基因的表达水平。在代谢工程途径优化中，根据不同启动子的强度精细调控目标基因的表达，对于实现中间代谢产物的生成与利用之间的平衡，进而提高目标产物的合成效率至关重要。
为了在 DA 合成过程中保持较低的 L-DOPA 水平并最大化 DA 产量，研究人员挑选了 3 种转录强度不同的启动子（T7、trc 和 M1-93，转录强度依次减弱）来调控 hpaBC 和 DmDdc 基因的表达。在菌株 DA-1 的基因组中，用不同组合表达 hpaBC 和 DmDdc 基因，构建出 9 种不同的重组菌株。研究发现，当 hpaBC 基因由最弱的 M1-93 启动子调控时，DA 产量起初随 DmDdc 启动子强度增强而增加，之后趋于平稳，且菌株 DA-8 和 DA-9 中 L-DOPA 积累量较低（≤0.03 g/L），可能是由于 L-DOPA 供应不足。当 hpaBC 基因由中等强度的 trc 启动子调控时，DA 产量随 DmDdc 启动子强度增强持续上升，在菌株 DA-12 中达到 1.47 g/L，同时 L-DOPA 积累量仍保持较低水平（≤0.03 g/L）。当使用强 T7 启动子调控 hpaBC 基因时，DA 产量也随 DmDdc 启动子强度增加而上升，尤其是在 T7 启动子控制下同时表达 hpaBC 和 DmDdc 的菌株 DA-15，DA 产量达到 1.83 g/L，但此时 L-DOPA 积累量增加到 0.65 g/L。综合考虑，选择 DA 产量高且 L-DOPA 积累量低的菌株 DA-12 进行后续研究。该组合策略相较于单一启动子系统的菌株，显著提高了 DA 产量，通过精确调控关键酶的表达，使工程菌株的 DA 产量从 0.77 g/L 提升至 1.47 g/L。
3. 解除抑制和反馈抑制：尽管通过引入 DA 表达元件、优化关键酶启动子以及补充外源 Tyr 能够合成 DA，但这种方法会增加生产负担，且效果并不理想，无法达到预期目标。要解决这一问题，需在细菌细胞内建立完整的 DA 合成途径。采用抗反馈抑制的酶、过表达途径酶以及增加中间代谢通量等策略，已被证明能有效提高芳香族氨基酸的合成效率 。
代谢途径的抑制和限速酶的反馈抑制是 DA 合成过程中的关键制约因素。失活 tyrR 基因可以解除对芳香族氨基酸积累的抑制 。DAHP 合成是芳香族氨基酸生物合成的关键步骤，磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）和赤藓糖 - 4 - 磷酸（Erythrose 4-phosphate，E4P）在 3 - 脱氧 - D - 阿拉伯庚酮糖酸 - 7 - 磷酸（DAHP）合酶的催化下转化为 DAHP，DAHP 的生成速率决定了芳香族氨基酸合成途径的整体进程。因此，调节大肠杆菌中 DAHP 的合成效率，能够显著促进后续代谢产物的合成 。DAHP 合酶由 aroG、aroF 和 aroH 基因编码，其中 aroG 的活性占总活性的 79%，aroF 占 20%，aroH 占 1%，解除 DAHP 合酶的反馈抑制对提高 DAHP 合成效率至关重要。此外，研究表明，分支酸变位酶（由 tyrA 基因编码）是从分支点酸到酪氨酸途径的限速酶，解除 tyrA 基因的反馈抑制对 DA 合成也具有重要意义 。
基于此，在菌株 DA-12 中，研究人员敲除 tyrR 基因，并引入突变基因 aroGfbr（D146 N）和 tyrAfbr（M53 I/A354 V），用 trc 启动子控制这些基因的表达，得到菌株 DA-16。该菌株能够利用葡萄糖而非酪氨酸合成多巴胺，产量达到 0.57 g/L。这一策略不仅使菌株能够内源性合成酪氨酸，还有助于进一步合成多巴胺，随着后续优化，有望获得更高的多巴胺产量。与添加外源酪氨酸的 DA-12 菌株相比，内源性合成酪氨酸在多巴胺合成方面具有显著优势。
4. 增强中间代谢通量：在大肠杆菌中，aroE 基因控制 DAHP 催化生成莽草酸，是莽草酸途径中的关键酶，而 tyrB 基因编码芳香族氨基酸转氨酶，催化酪氨酸生物合成的最后一步 。为进一步提高 DA 合成途径中的碳通量，研究人员在菌株 DA-16 中用 trc 启动子过表达 aroE 和 tyrB 基因，得到菌株 DA-17。摇瓶发酵测试显示，菌株 DA-17 的 DA 产量达到 0.89 g/L，相比 DA-16 提高了 36.8%。
5. 重新设计中心代谢途径：大肠杆菌利用 PEP 和 E4P 作为底物，在 DAHP 合酶的作用下缩合生成 DAHP，随后 DAHP 进入莽草酸途径参与芳香族氨基酸的生物合成。在优化芳香族氨基酸生产过程中，平衡三羧酸循环（TCA cycle）与 DA 合成途径之间的碳通量，对细胞生长和产物合成至关重要 。为了在不影响细胞生长的前提下，提高 DAHP 合成过程中 PEP 的可用性，重新引导 PEP 代谢路径至关重要。PEP 在丙酮酸激酶（PykA 和 PykF）的催化下转化为丙酮酸。
研究人员在 DA-17 细胞中分别敲除 pykA 和 pykF 基因，得到菌株 DA-18 和 DA-19。这两种菌株的 DA 产量分别为 0.99 g/L 和 1.08 g/L，相比 DA-17 分别提高了 26.9% 和 38.5%，但它们的 OD600 nm 值相比 DA-17 分别下降了 11.3% 和 13.2%，这表明单独敲除 pykA 或 pykF 基因，虽然能使 DA 积累有所增加，但效果有限。当同时敲除 pykA 和 pykF 基因时，得到的菌株 DA-20 的多巴胺产量为 0.61 g/L，OD600 nm 值为 22.5。丙酮酸磷酸双激酶（Pyruvate phosphate dikinase，PPS）能够将丙酮酸转化为 PEP，研究人员用 trc 启动子增强菌株 DA-18 和 DA-19 中 pps 基因的表达，得到菌株 DA-21 和 DA-22。其中，菌株 DA-21 的 DA 产量显著提高到 1.21 g/L，相比菌株 DA-18 增加了 22.2%，而菌株 DA-22 的 DA 积累量仅为 0.86 g/L，相比 DA-19 下降了 20.4%。这一结果表明，过多的碳通量直接进入 DA 合成途径，会削弱 PEP 向丙酮酸的转化，进而减少进入 TCA 循环的碳通量，影响细胞的正常生长。因此，研究人员基于菌株 DA-21 的最佳 DA 产量表现，对其进行了进一步改造。
尽管研究人员将 PEP 代谢途径重定向到 DA 合成，但结果并不理想，DA 积累量仅略有增加，这表明 E4P 是 DA 合成途径中的限制性底物。在 E4P 供应不足的情况下，增加 PEP 通量并不能显著提高 DA 产量。为解决这一问题，研究人员在菌株 DA-21 中上调与 E4P 合成相关基因的表达，用 trc 启动子在 yeeP 和 yjgX 位点过表达 tktA 和 talB 基因，得到菌株 DA-23 。与 DA-21 相比，菌株 DA-23 的 DA 产量提高了 29.5%，同时 L-DOPA 积累量保持较低水平（≤0.03 g/L），且细胞浓度没有明显变化，这表明 E4P 积累对 DA 合成具有明显的促进作用。
6. 关键酶基因拷贝数的优化：为进一步提升 DA 的合成能力，研究人员在菌株 DA-23 中分别引入 hpaBC 和 DmDdc 基因的双拷贝、三拷贝和四拷贝，优化其表达，得到菌株 DA-24、DA-25 和 DA-26，并以 DA-23 作为对照。结果显示，随着基因拷贝数的增加，DA 产量先上升后下降，菌株 DA-25 的 DA 产量最高，达到 4.58 g/L，这表明三拷贝表达有利于 DA 的合成。然而，过多的基因拷贝并不能进一步提高 DA 产量，反而会导致产量下降。因此，研究人员选择产量较高的三拷贝菌株 DA-25 进行后续改造。
7. FADH2-NADH 辅助因子供应系统的构建：FADH2（还原型黄素腺嘌呤二核苷酸）是维生素 B2 的衍生物，作为还原型辅酶参与电子传递和氧化磷酸化过程，生成 ATP 。在大肠杆菌中，HpaB 是一种依赖 FADH2的羟化酶，在 FADH2存在的情况下催化酪氨酸的羟基化反应。随后，hpaC 利用 FAD 和 NADH 在细胞内合成 FADH2 。FADH2的再生速率可能会限制酪氨酸羟基化的效率，因此提高 FADH2的再生速率对提升 DA 合成至关重要。大肠杆菌中的黄素还原酶由 fre 基因编码，它以黄素为底物，消耗 NADH 将 FAD 转化为 FADH2，从而为 HpaB 提供额外的 FADH2 。
研究人员用 trc 启动子增强菌株 DA-25 中 fre 基因的表达，促进细胞内 FADH2的循环，得到菌株 DA-27。与 DA-25 相比，菌株 DA-27 的 DA 产量提高了 9.7%，达到 4.91 g/L，这表明过表达 fre 基因有效促进了 HpaBC 介导的羟基化过程。
虽然过表达 fre 基因提高了 HpaBC 的羟基化效率，但这一过程可能会过度消耗细胞内的 NADH，影响细胞的正常生长和代谢。因此，调节 NADH 水平，维持细胞内的氧化还原稳定至关重要。有研究表明，以甘油为碳源可增加 NADH 的利用，使 L-DOPA 产量提高近两倍 。提高 NADH 水平的策略包括阻断竞争性 NADH 途径和构建 NADH 再生途径。乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，AdhE）催化乙酰辅酶 A 还原为乙醛，这一过程会消耗 NADH。研究人员敲除菌株 DA-27 中的 adhE 基因，得到菌株 DA-28。摇瓶发酵结果显示，与菌株 DA-27 相比，DA-28 的 DA 积累量和 NADH/NAD⁺比值分别提高了 7.3%（达到 5.27 g/L）和 17.4%（达到 0.54）。此外，gapA 基因编码甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶，是糖酵解过程中 NADH 的主要来源，过表达 gapA 基因能够有效提高细胞内 NADH 水平。在菌株 DA-28 中过表达 gapA 基因，得到菌株 DA-29。摇瓶发酵结果显示，DA-29 的 DA 产量达到 5.71 g/L，相比 DA-28 提高了 8.4%，且 NADH/NAD⁺比值保持不变。这表明增强 NADH 供应可间接促进 FADH2再生，显著促进 L-DOPA 合成，从而提高 DA 的合成效率。
8. 两阶段 pH 发酵过程：在发酵过程中，研究人员观察到随着 pH 值升高，发酵液颜色逐渐变黑，DA 积累量减少。由于多巴胺在酸性环境中可被质子化，质子化的 DA 具有高水溶性和稳定性，因此推测发酵过程中 pH 值升高可能导致 DA 降解，抑制其积累。为减少 DA 的氧化降解，研究人员探究了不同 pH 条件对 DA 合成的影响，选取了 4 个 pH 值（6.0、6.5、7.0 和 7.5），观察其对发酵结果的影响。
发酵结果显示，当 pH 值超过 7.0 时，DA 产量较低，这可能是因为高 pH 值影响了菌株的生长，进而导致部分 DA 降解。在 pH 值为 6.5 时，DA 产量最高，达到 15.35 g/L，且菌株生长状况明显优于其他 pH 条件。在 pH 值为 6.0 时，DA 产量虽较低，为 11.13 g/L，但发酵末期 DA 的降解量在所有条件中最低，这表明 pH 值为 6.0 虽然不利于细胞生长，但可能更有利于 DA 的保存。
基于上述发现，研究人员探索了两阶段 pH 调控发酵过程。在发酵初期，将 pH 值控制在 6.5，以支持细胞的正常生长；当细胞进入稳定期（约 20 小时）后，将 pH 值降至 6.0，以减少 DA 的降解。采用菌株 DA-29 进行两阶段 pH 发酵，结果显示 DA 产量达到 17.16 g/L，相比 pH 值为 6.5 的发酵条件
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