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«生命的化学»2001年21卷1期
张 伟 明镇寰
(浙江大学生命科学学院，杭州 310012)
关键词：细胞周期检验点；核糖核苷酸还原酶(RNR)；DNA修复
中图分类法：Q753
1. p53基因及P53蛋白
p53基因最初被认为是一个普通的癌基因，其产物的作用是刺激肿瘤细胞的生长。但后来发现原先研究的p53基因只是野生型p53基因的突变体，只有突变型p53基因的产物才能刺激不正常细胞(如癌细胞)的生长，而野生型p53基因的产物对肿瘤则有抑制作用，正常的p53基因原来是一个抑癌基因。经长期研究发现，突变型p53基因在人类多种钟瘤细胞中广泛存在。
P53蛋白是p53基因编码的蛋白转录因子，其相对分子质量为5.3
× 103，是由393个氨基酸残基组成的[1]。P53蛋白是一种重要的抗肿瘤因子，它能以序列特异的方式与靶DNA结合，调节靶基因的转录。在这些靶基因中，最著名的一个就是在1993年发现的WAF1/Gip1基因，此基因编码的蛋白质P21可以与依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)结合，并抑制CDK的活性，从而使细胞分裂停滞在中期[1~3]。后来发现，这种滞留作用可以使细胞对损伤的DNA进行修复，以避免损伤DNA的复制，防止损伤细胞
的增殖，降低细胞癌变的发生率。
既然P53蛋白具有防止受损细胞的致癌作用，那么是否对DNA的员伤也有修复作用呢?Tanaka等研究发现P53蛋白在DNA的损伤修复中确实具有重要作用。
2. 核糖核苷酸还原酶(RNR)的结构和功能
从酶母和小鼠实验所得到的证据表明核糖核苷酸还原酶(RNR)在DNA的复制和修复中具有重要的作用，RNR是催化核糖核酸转变为脱氧核糖核苷酸为DNA合成和修复提供所需dNTPs的限速酶[4、5]，不同的生物体和细胞周期的不同阶段所含有的RNR种类和数量是不同的[2,5]。
人体细胞中含有两种类型的RNR，其中细胞质内所含的RNR是由两个不同亚单位组成的α2β2四聚体，大亚单位R1含有维持和平衡dNTPs池的别构调节位点；小亚单位R2含有一个双核铁原子中心和一个能将核糖核苷酸酶催转变为脱氧核糖核苷酸所必需的酪氨酰游离基团。哺乳动物细胞质中的核糖核苷酸还原酶是受细胞周期调节的，小亚单位R2产生于DNA复制前的晚G1期，而在晚S期或早G2期消失；与之相比，大亚单位R1则在整个细胞周期都产生[5,6]。细胞质核糖核苷酸还原酶催化产生的dNTPs可通过渗透作用进入细胞核，用于DNA复制。人细胞核中也含有一种RNR，但其结构和功能与细胞质中的RNR有所不同[5]。
在酵母中也报道了四种RNR亚单位(RNR1、RNR2、RNR3、RNR4)，RNR1和RNR3与R1大亚基相对应，彼此间有80%相同性；RNR2和RNR4与R2小亚基相对应，但RNR4缺少dNDP催化域。RNR1在整个细胞周期都出现，并且受DNA损伤的轻微诱导，而RNR3 mRNA受DNA损伤的诱导会增加100多倍[2,7]，这表明大亚基至少有两种不同的转录调节机制。研究显示酵母RNR1和人细胞质中的R1在S期参与维持用于DNA复制的dNTPs池；而酵母RNR3则为DNA损伤的紧急修复提供dNTPs[2]。
3. p53R2基因及其功能
Tanaka等从人骨骼肌的cDNA文库中分离到一种P53诱导基因，由于该基因与酵母RNR2和RNR4基因序列的相似率分别为60%和40%，其编码的一段由351氨基酸残基组成的多肽与人细胞质中的RNR的小亚单位R2有80%的相似性，因此认为该基因是酵母RNR2基因的相似基因，并将其命名为p53R2基因，序列比较显示其编码蛋白P53R2是RNR2和R2的同系物，所以p53R2是一个基因，它编码的P53R2蛋白与同系物R2具有相同的功能[2,8]。利用荧光位点杂交(FISH)分析技术，Tanaka等将p53R2基因定位在染色体8q23.1上，它是由大约30kb大小的9个外显子构成的，在其内含子1上含有20个核苷酸的P53蛋白DNA结合序列，这段DNA序列对P53蛋白直接激活p53R2基因转录是必需的[2]。
尽管P53R2蛋白与细胞质RNR的R2亚单位密切相关，但它们在细胞中的存在部位却截然不同，P53R2蛋白不是存在于细胞质中，而是存在于细胞核中(当然在细胞质有一个合成过程，合成后立即运送到细胞核中)[5]。不同的存在位点是否会造成其功能上的差异呢?根据P53R2与R2的高度相似性，Tanaka等推测：DNA的复制需要细胞质内合成dNTPs，而损伤DNA的修复则可能需要核内合成的的dNTPs，这个过程可能需要P53R2的参与。为了验证P53R2是否具有修复功能，有人用反义DNA抑制p53R2基因，观察到经紫外线照射或阿霉素处理后参入到损伤DNA中的dNTPs明显降低；此外，实验也证实不能产生正常P53R2蛋白的细胞对DNA损伤剂的作用是敏感的[2]。
Tanaka等检验了蛋白质P53R2和R2在含有野生型P53的NHDF(normal human dermal fibroblast line)细胞周期各阶段的表达情况，在整个细胞周期P53R2的表达水平没有差异，但R2的mRNA在S期显著增加；P53R2是否接受DNA损伤的诱导呢?研究发现，当将NHDF细胞暴露于紫外线或阿霉素后，p53R2的转录以时间依赖的方式被显著诱导，与之相比，由于受紫外线或阿霉素的处理，细胞周期被阻断，R2的表达则受到抑制。然而，当缺少野生型P53的SW480细胞系或H1299细胞系受γ-射线、紫外线或阿霉素处理后，P53R2的表达并不被诱导，这表明p53R2基因对于DNA损伤的诱导可能依赖于野生型P53的存在[2]。
为了验证内源P53R2蛋白具有依赖P53的DNA修复活性，Tanaka等利用γ-射线照射含有野生型P53蛋白和依赖P53-DNA修复检验点功能的MCF7细胞使其DNA损伤，发现p53R2基因的表达受到强烈诱导，而R2的转录却以时间依赖的方式被抑制，在12h时MCF7细胞的细胞周期被完全阻断在G1和G2期，这种阻断至少维持到DNA损伤后48h。在损伤的MCF7细胞中，通过核糖核苷酸还原酶的DNA修复活性在DNA损伤后48h以时间依赖的方式显著增强，P53R2蛋白也被强烈诱导，并在损伤细胞的核内积累。这种增强的活性并不是由于S期细胞内DNA合成或DNA复制，因为FACS(fluorescence-activated cell sorting)显示细胞周期被完全阻断在G1和G2期，几乎没有S期细胞的存在。此外，实验还显示在H1299细胞系和无P53肿瘤细胞中，这种诱导作用却很少发生。这些结果表明G1和G2期的阻抑、P53R2的表达和核内积累以及核糖核苷酸还原酶的激活都是以依赖P53的方式为修复损伤的DNA而被诱导的。
综上所述，在人体中核糖核苷酸还原酶的两个小亚单位R2和P53R2的转录调节活性是不同的，R2在S期参与维持用于DNA复制的dNTPs池；而P53R2的作用可能是为受损DNA的修复合成应急前体物[2,5]，这些用于DNA修复的前体是通过P53R2将核糖核苷酸二磷酸还原后供给的，而不是来自于dNTPs池，原因如下：①与其它的核糖核苷酸还原酶蛋白不同，当细胞周期因DNA损伤而阻断时，P53R2被转运至核内；②在没有DNA损伤时细胞内核糖核苷酸还原酶的水平远低于DNA损伤时的水平；③DNA损伤后核糖核苷酸还原酶活性和DNA合成活性的增加不会受到加入的dCTP的抑制干扰[2]；因此可以推测，P53R2的核糖核苷酸还原酶活性并不是为了维持dNTP池，而是为DNA的紧急修复提供前体，P53R2可能直接参与构成DNA修复的蛋白质复合体。需要特别强调一点的是，P53R2参与DNA修复过程是以依赖P53的方式进行的，p53R2基因是P53尽白的一个直接靶基因，其转录活性受到P53的调控。
4. DNA损伤修复的假拟模式
人们很早就了解到dNTPs参与DNA的复制和损伤修复，p53R2基因及其产物P53R2蛋白的发现和分离研究，丰富和加深了人们对DNA修复机制的认识，在目前的认识基础上，人们提出了有关人(或哺乳动物)和酵母细胞中损伤DNA的修复途径。酵母和哺乳动物的DNA损伤修复途径显示出很大的相似性，(如图1所示)在人体细胞中，ATM和ATR首先激活CHK2，接着经多步作用活化P53蛋白[2,5,9]，P53再通过直接激活p53R2基因的转录诱导产生P53R2蛋白，随后P53R2催化生成dNTPs并用于损伤DNA的修复；在酵母中，ATM和ATR类似物TEL1和Mec1激活CHK2的类似物RAD53，接着蛋白激酶DUN1被激活，随后DUN1磷酸化并阻止抑制因子CRT1结合到酵母RNR基因的启动子上，RNR基因被活化转录，生成的RNR蛋白用于损伤DNA的修复[2,5,10]。
图1 酵母和人损伤DNA修复模式示意图
5. DNA修复机制在肿瘤治疗上的应用前景
我们知道缺少正常P53R2蛋白和P53蛋白的细胞对DNA损伤是敏感的。但由于细胞质中RNR催化产生的dNTPs可经渗透作用进入细胞核，而使这些损伤DNA具有微弱的修复作用。如果能找到对细胞质RNR特异性的抑制因子，这些因子不妨碍野生型细胞通过p53R2基因表达而进行DNA修复功能，但能选择性地使P53突变细胞对化疗剂敏感，由于这些细胞中P53R2蛋白于P53蛋白的突变而丧失正常功能，因此可以彻底关闭P53突变型肿瘤细胞的DNA修复作用。由于多种类型的人类肿瘤是p53基因的突变相关，所以这就为抗肿瘤药物的研制提供了新的策略[5]。但有一个重要的问题是：要寻求这样的抑制因子，就必需首先弄清P53R2是与哪一个RNR亚单位相结合来激活核内dNTPs合成的，是R1亚基还是与R1相关的其它蛋白因子?这还需要进一步地研究。
参考文献
[1]
明镇寰：生物化学与分子生物学新概念，杭州：浙江大学出版社，1999，227-280
[2] Hiroshi Tanaka et al. Nature,20000,404:42-49
[3] Harper J W et al. Cell,1993,75:805-816
[4] Jordan A et al. Annu Rev Biochem,1998,67:71-98
[5] Guillerminas Lozano et al. Elledge,2000,Nature,404:24-25
[6] Bjorklund S et al. Biochemistry,1990,29:5452-5458
[7] Elledge S J et al. Genes Dev,1990,4:740-751
[8] Reichard P. Science,1993,260:1773-1777
[9] Banin S et al. Science,1998,281:1674-1677
[10] Zhou Z et al. Cell,1993,75:1119-1127
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