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长片段的克隆一直是个棘手的问题。片段越长，克隆效率越低。这似乎成为了一可怕的魔咒，环绕着研究人员。然而，在克隆中讲究合适的策略，并辅以恰当的产品，打破魔咒并不是问题。本文就介绍了一些长片段克隆的策略和注意事项，以及适合的产品。
如果你的目的片段大于5kb，那么注定你会比别人多一份艰辛。长片段的扩增与克隆都并非易事。现在前面的问题已经基本解决了。许多DNA聚合酶都可以扩增长片段，30kb也不在话下。广告说的好，比你想象的更长。而且高保真酶的保真效率也不断提高，再也不用害怕PCR产物频频突变了。不过，长片段的克隆还是个棘手的问题。片段越长，克隆效率越低。这似乎成为了一可怕的魔咒，环绕着研究人员。
然而，在克隆中讲究合适的策略，并辅以恰当的产品，打破魔咒并不是问题。首先，为了增加克隆效率，长片段PCR产物最好经过跑胶纯化。但在传统凝胶电泳中，结合了EB的DNA需要暴露在紫外光下，会造成DNA损伤，并显著降低克隆效率。短的PCR产物还不打紧，这对长片段来说是致命的。为了避免这个问题，我们可以换个染料。结晶紫就是个不错的选择。结合了结晶紫的PCR产物能在普通灯下观察，呈现紫色条带。在跑胶的过程中，我们能清楚地观察到PCR产物的位置，一旦与其他条带很好地区分，就可以切胶纯化了。不过结晶紫的灵敏度不如EB，200ng的DNA才勉强可见。所以长片段的PCR产物还是多多益善。另外，结晶紫可不适用于平时我们用的loading buffer，因为其中的溴酚蓝或二甲苯蓝会与结晶紫相互作用，使DNA条带失真。6×loading buffer的配方是30%的甘油、20 mM EDTA和100 ug/ml 结晶紫。其次，对于10 kb以上的质粒，电转的效果会比化学转化好。
Invitrogen的长片段克隆试剂盒中就包含了结晶紫染料。这个试剂盒名为TOPO XL PCR Cloning Kit，XL以示与其他试剂盒的不同。它适用于3-10 kb的片段，原理也是5分钟的TOPO克隆。只要带有A尾巴的PCR产物就行，无需对引物进行特别设计。载体上LacZa片段的C端还融合了ccdB致死基因。长片段PCR产物的连接会破坏lacZa-ccdB基因的表达，这样转化之后平板上出现的都是阳性克隆，连蓝白斑筛选都省了。价格是4320元/10次，确实挺贵。
Clontech公司著名的In-Fusion PCR克隆试剂盒也能对付12 kb以下的片段。In-Fusion技术设计巧妙，操作简单方便，不需要借助任何限制性内切酶、连接酶、或者磷酸化、补平末端等手段，利用Cre重组酶完成PCR产物与载体的同源重组，30分钟内能将任何PCR产物片断精确地定向克隆到任何你想要的载体上。克隆的位置不受酶切位点的限制，也不需要另外购买T载体，因此成为最受欢迎的克隆产品。试剂盒中专利的Cloning Enhancer能消除质粒DNA背景和PCR残基，省却了PCR产物纯化的步骤，也避免了长片段PCR产物的损失或损伤。而且，它处理过的样品能产生更多的重组克隆，对长片段特别有利。目前的售价是1689元/10次。
如果你的目的片段大于12 kb，那也不用崩溃，罗氏的Expand Cloning Kit能克隆7-36 kb的DNA片段。它的特别之处就在于抛弃了传统的质粒，使用了特殊设计的粘粒载体。PCR产物经过打磨去掉A尾巴后，可与平末端的Expand载体连接。Expand载体有I、II、III三种形式，大小不同，分别能克隆7.0-16.5 kb、16.5-25 kb、25-36 kb的长片段。重组粘粒随后包装进λ噬菌体，并感染大肠杆菌。通过抗生素筛选即可得到阳性克隆。整个过程涉及到粘粒和噬菌体，就比传统的克隆复杂了很多。噬菌体的操作也要特别小心，以免感染了实验室中其他的大肠杆菌。此产品价格不菲，10次反应高达7293元。唉，没办法，谁叫你的片段那么长呢。
长片段的克隆虽然不易，但也并非不可能的任务。除了小心操作外，关键是要选对合适的产品和技术。当然，也还需要一点点好运气。祝你好运！
（生物通 余亮）
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