编辑推荐：
遗传与变异，是生物界中普遍发生的现象。拷贝数变异（CNV）作为其中的一种，因其在人类疾病（如糖尿病、心脏病、癌症、自闭症和精神分裂症）中的作用被不断发现，最近也受到了越来越多的关注。如今我们有了一些新工具，能获得更为清晰的基因组图像。
遗传与变异，是生物界中普遍发生的现象。拷贝数变异（CNV）作为其中的一种，因其在人类疾病（如糖尿病、心脏病、癌症、自闭症和精神分裂症）中的作用被不断发现，最近也受到了越来越多的关注。
作为大规模基因组事件（如缺失、重复、倒位和易位）的后果，CNV指的是DNA片段的拷贝数发生变化，而不是单个核苷酸的差异，即SNP。CNV比人们想象的更为常见。多伦多大学儿童医院应用基因组学中心的主任Steve Scherer谈道：“令人惊讶的是，CNV和插入缺失覆盖的核苷酸总数超过SNP的10倍。”
过去，遗传学家通常利用荧光原位杂交（FISH）和早期的芯片来鉴定CNV，但那些方法的分辨率有限。如今我们有了一些新工具，能获得更为清晰的基因组图像。
芯片
如今的芯片已不能与过去同日而语。杂交点越来越密集，探针也更有针对性，新的芯片带来了更高分辨率的基因组分析，实现了更小结构变异的检测。
Scherer表示：“在最初的发现研究中，我们以1 Mb的分辨率扫描基因组，到了2010年，我们达到100 kb左右，如今我们轻松地实现了10 kb。由于基因的平均大小约为60 kb，这意味着我们能够发现基因中的CNV，在基因型和表型关联研究中获得更高的特异性。”
为SNP研究而设计的工具也在CNV分析中发挥作用。例如，Affymetrix的Genome-Wide Human SNP Array 6.0利用180多万个SNP标记来评估基因组中的拷贝数状态。该公司的CytoScan® 细胞遗传学方案也是另一种类型的基因组范围芯片。
据Affymetrix临床应用营销部门的副总裁Dara Wright介绍，这款芯片覆盖了基因组中的每个基因，旨在拷问非多态性和多态性区域。Wright表示：“由于临床细胞遗传学是一个不断学习的学科，使用定向芯片会明显限制临床产出。全基因组芯片让研究人员能够以无假说的方式分析拷贝数变异。”CytoScan HD Array有260多万个拷贝数标记，可检测25 kb至50 kb的拷贝数变化。
Affymetrix还为癌症研究人员提供了一款拷贝数分析，名为OncoScan™ FFPE，它覆盖了整个基因组，但主要集中在癌基因和肿瘤抑制基因上。OncoScan分析不仅能够接纳起始量极低的样本（<80 ng DNA），还能靶定更小的基因组DNA区域（约40 bp）。这对于肿瘤活检样本来说很关键，因为它们常以福尔马林固定石蜡包埋，DNA往往降解。OncoScan™ FFPE如今作为Affymetrix的一项服务提供，但在今年晚些时候会推出试剂盒。
其他厂家也提供高分辨率的CNV分析芯片，包括Illumina的Infinium HumanCore BeadChip芯片和安捷伦的Human Genome CGH芯片。
宾夕法尼亚大学医学院的儿科副教授Hakon Hakonarson认为，这些高分辨率的芯片让研究人员能够检测更小的基因组变化，发现过去未知的基因组变异。“它们让我们了解到一些很小但对疾病有影响的CNV。我们过去无法检测它们，因此一无所知。”
PCR
另一种检测CNV的方法是PCR。实时定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）都比芯片更为定量，也就是说，能更好地测定基因拷贝数的变化，同时也能测定较小区域内的CNV。就样品通量而言，PCR分析也比芯片和测序方法有优势。
dPCR和qPCR的差异在于它们计算特定目标的方法。qPCR测定荧光信号超过阈值所需的扩增循环数。将此循环数与标准曲线进行比较，从而计算出转录本的丰度。相比之下，dPCR直接计算目标分子。
在数字PCR中，反应混合液被分成多个（数千个至数百万个）微小反应。每个反应如此小，只包含1个DNA分子，甚至没有。实际上，每个反应都是二元的，要么阳性，要么阴性。Bio-Rad数字生物学中心的资深科学家Jennifer Berman解释道，计算这些离散的信号让你能够定量样品中DNA分子的绝对数量。
分液是通过仪器来实现的。Bio-Rad的QX100™ 数字PCR系统和RainDance Technologies的RainDrop™系统都使用微滴，而Life Technologies的QuantStudio™ 3D数字PCR系统利用dPCR板上的微孔。
Fluidigm的qdPCR 37K™ IFC系统则是凭借该公司在微流体设计上的专长，将dPCR反应分成微小的微流体室。据Fluidigm分子生物学和分析开发的主管Ramesh Ramakrishnan介绍，这一系统采用一种内置的方法来监控反应效率。
“运行终点分析的危险在于它削弱了你区分真实信号和假阳性的能力，”Ramakrishnan说。相比之下，Fluidigm的系统不断监控qPCR反应，这样研究人员能确保扩增的酶在实验和对照分析中同样高效地发挥作用。“尽管我们的系统是在数字模式下测定，但它也收集每个循环的实时图像。这是一种内置方法，可发现拷贝数结果是真阳性，还是假阳性。”在某些情况下，如癌症诊断检测，这一额外的安全检查非常有价值。
NanoString Technologies的nCounter CNV CodeSets尽管在技术上并非dPCR，但它也能提供高分辨率的CNV测定。在这种数字检测技术中，包含荧光标签的分子“条形码”被检测，并通过单分子成像来计数。这种技术有着强大的多重分析能力，让研究人员能分析单管中多达800个位点。
许多厂家也提供qPCR分析，用于CNV检测，如Life Technologies、Fluidigm和Qiagen。Qiagen最近发布了一种不同的工具，可改善拷贝数测定。一般来说，通过qPCR测定拷贝数需要参考基因便于比较。Qiagen新的参考分析依赖位于基因组中多个位点的重复序列。Qiagen的全球产品经理Brian McNally表示：“这一分析改善了拷贝数测定的准确性，它让拷贝数确定对单个参考位点的拷贝数变化不敏感，从而更好地测定了DNA总量。”
新一代测序
CNV检测的最后一招是新一代测序（NGS）。然而，它若想成为常用方法，还需要克服一些技术障碍。
Scherer认为：“外显子组和全基因组测序的确能发现一些单碱基和插入缺失变化，最多100 bp，但应用程序的缺乏让它难以找到中间的以及更大的CNV。”在CNV分析中使用测序的缺点在于需要几天，甚至几周，而PCR运行只需几小时。另一个需要注意的是要确保测序结果是真实的，这可能会带来更深度测序。但Ramakrishnan强调NGS擅于发现未知变化。他认为，测序之后采用PCR来深度跟进将是一个特别强大的组合。
尽管技术在不断进步，但科学家们对于CNV仍有很多东西需要学习。例如，什么是正常量的变异？这必须先将某些量定义为异常。Wright也提到将CNV事件与临床注释相关联的重要性，以便加强表型-基因型的关联，或基因组结构与疾病状态的关联。她认为：“在所有情况下都要收集临床结果的信息，以便了解新兴的CNV分析技术的临床实用性。”
（Caitlin Smith /编译：薄荷）
生物通微信公众号
生物通 版权所有
