PLAG1与IGF-1R基因多态性对马都拉牛不同生长阶段体重及体型性状的关联分析

本研究首次在印度尼西亚本土马都拉牛中揭示了PLAG1基因AC_000171.1:g.48308C>T和IGF-1R基因JQ924783.1:g.269418A>G多态性与关键生长性状（体重、体长、体高）的显著关联。通过PCR-RFLP对145头牛进行基因分型，发现PLAG1多态性影响出生和周岁体重与体高，而IGF-1R多态性影响断奶期和周岁的体长与体高。这些基因为标记辅助选择（MAS）提供了分子依据，有助于在保持品种适应性的同时提升生长性能。

引言

马都拉牛是印度尼西亚著名的本土肉牛品种，以其对热带气候的卓越适应性而闻名。这些牛表现出对环境胁迫因子的高耐受性，能够在低质量饲草条件下茁壮成长，并具有抵抗蜱等外部寄生虫的能力。然而，其生产性能相对一般。平均出生体重约为18.65 ± 2.01公斤，断奶体重公母平均分别为80.97 ± 18.45公斤和79.60 ± 20.58公斤。成年时，公牛体高约120厘米，母牛约105厘米，体重在220-250公斤之间，屠宰率为50.96%–51.72%。与进口的商业品种相比，马都拉牛生长速度较慢，平均日增重仅为0.3–0.6公斤。

为了提高马都拉牛的经济价值，同时保留其独特的适应性性状，必须采用遗传改良策略。仅基于表型的传统选择方法通常耗时且效率较低，特别是在低投入的育种系统中。标记辅助选择（MAS）提供了一种强有力的替代方案，它能够早期、准确地识别携带理想遗传变异的动物。通过使用与体型、体重和胴体品质等性状相关的分子标记，MAS可以加速遗传进展并提高选择的精确性。

多形性腺瘤基因1（PLAG1）和胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）是两个参与动物生长的重要候选基因。PLAG1基因编码一种转录因子，调控包括IGF2在内的多个参与细胞增殖和组织分化的下游基因。PLAG1的多态性已被证明与多种牛品种的出生后生长、体重和体型性状相关，例如巴厘牛。具体而言，位于PLAG1基因3'非翻译区（3'UTR）的AC_000171.1:g.48308C>T突变可能通过影响mRNA稳定性或其与microRNA的相互作用来调节基因表达。与之并行，IGF-1R基因在胰岛素样生长因子信号通路中扮演关键角色，介导生长激素的作用，并促进骨骼生长和蛋白质合成。IGF-1R基因第12外显子中的JQ924783.1:g.269418A>G多态性虽为同义突变，但已在多个牛群中与生长性状相关联，尽管结果因遗传背景不同而存在差异。

尽管这些基因功能重要，但研究PLAG1和IGF-1R基因多态性与马都拉牛生长性状关联的报道仍然有限。作为一种具有重要文化和经济意义的本地品种，马都拉牛需要遗传特征分析以支持可持续的育种计划。因此，本研究旨在（1）估算马都拉牛中AC_000171.1:g.48308C>T（PLAG1）和JQ924783.1:g.269418A>G（IGF-1R）多态性的等位基因和基因型频率；（2）评估这些多态性在不同生长阶段与体重和体型性状的关联。研究结果有望提供分子层面的见解，支持在该重要本地品种中实施标记辅助选择策略以改善生长性能。

材料与方法

伦理声明

实验方法获得了布拉维贾亚大学医学院健康研究伦理委员会的批准（伦理批号126/EC/KEPK/05/2025）。研究确认关键研究和方法学细节已包含在手稿中。

动物与数据收集

本研究共使用了145头马都拉牛。所有动物均在印度尼西亚南加里曼丹的BPTU-HPT Pelaihari育种站饲养和管理。从每头动物采集血液样本，作为遗传分析的基因组DNA来源。所有涉及动物的操作均遵循动物福利指南和伦理标准。为了最小化环境变异，所有牛只在统一的饲养管理条件下饲养，包括标准化的饲喂和圈舍实践。本研究中测量的定量体型性状包括体重、体长、体高和胸围。测量方法遵循印度尼西亚国家标准（Standar Nasional Indonesia）概述的规程。

DNA提取

从全血样本中提取DNA采用了基于Sambrook和Russell方法的改良方案。提取步骤包括：（1）样本制备：300 μL全血与900 μL红细胞裂解缓冲液混合，匀浆后以3,000 rpm离心5分钟，弃上清，保留沉淀用于后续处理。（2）蛋白质降解：向沉淀中加入40 μL 10% SDS、10 μL蛋白酶K（5 mg/mL）和1×STE缓冲液至总体积400 μL，混合物在55°C孵育2小时，缓慢摇动。（3）有机物质降解：向裂解液中加入400 μL苯酚、400 μL氯仿:异戊醇（24:1）和40 μL 5 M NaCl，室温轻柔混合1小时。（4）溶液以12,000 rpm离心5分钟，分离含DNA的水相。（5）DNA回收：将水相转移至新管，加入800 μL无水乙醇和40 μL 5 M NaCl，-20°C过夜沉淀DNA。之后，样本再次以12,000 rpm离心5分钟，弃上清，DNA沉淀室温风干，最后溶解于100 μL TE缓冲液（80%）中。

PLAG1和IGF-1R基因的扩增与基因分型

用于扩增PLAG1基因3'UTR区域AC_000171.1:g.48308C>T靶片段（628 bp）的引物依据Zhong等人的研究，而用于扩增IGF-1R基因第12外显子JQ924783.1:g.269418A>G片段（604 bp）的引物使用NCBI的Primer-BLAST工具设计。PLAG1基因的SNP选择基于Zhong等人的研究，IGF-1R基因的SNP选择依据Szewczuk等人的研究。引物序列见表1。

聚合酶链式反应（PCR）总反应体积为25 μL，包含：DNA样本（50 ng/μL）、正反向引物（各0.5 pmol）、GoTaq^® Green Master Mix（Promega；含0.5单位Taq DNA聚合酶）和无核酸酶水补足体积。PCR扩增使用热循环仪（GeneAmp^® PCR System 9700, Applied Biosystems^™）进行。热循环条件为：初始变性95°C 10秒，退火60°C 20秒，延伸72°C 30秒，共30个循环。

基因分型采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法。使用限制性内切酶SacII消化PLAG1基因片段，MspI消化IGF-1R基因片段。PCR产物与相应内切酶在65°C孵育12小时以确保完全消化。消化产物在2.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用FluoroSafe DNA Stain（1^st Base, Singapore）染色，并通过凝胶成像系统（Alpha Imager, Alpha Innotech）在紫外透射仪下观察DNA片段。

数据分析

遗传多态性通过计算基因型频率、等位基因频率、观测杂合度并进行哈迪-温伯格平衡（HWE）检验进行评估，方法遵循Nei和Kumar的描述。PLAG1/SacII和IGF-1R/MspI基因型与体型性状（体重、体长、体高、胸围）的关联性使用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。当检测到显著效应时，采用Duncan多重范围检验（DMRT）确定基因型均值间的统计学显著差异。遗传效应分析使用以下模型：Y_jk = μ + G_j + ε_jk，其中Y_jk代表具有j基因型的k个体的表型观测值，μ为总体均值，G_j代表j基因型的固定效应，ε_jk为残差误差。所有统计分析均使用R软件（版本4.4.2）在Visual Studio Code环境中进行。HWE基因型频率使用table()函数计算，卡方检验使用chisq.test()函数进行。假设检验前，通过Shapiro-Wilk检验（shapiro.test()函数）评估残差正态性，并使用car包中的Levene检验进行方差齐性检验。ANOVA估计值的标准误（SE）由均方误差（MSE）除以每组样本量得出，并用于构建基于t分布的95%置信区间（CI）。方差分析使用aov()函数进行，事后均值比较使用agricolae包中的DMRT进行。为控制多重比较，使用p.adjust()函数和错误发现率（FDR）方法对p值进行校正。所有输出结果使用openxlsx包整理并导出至Excel文件。

结果与讨论

PLAG1和IGF-1R基因的多态性

145份马都拉牛DNA样本均成功扩增，IGF-1R基因获得604 bp片段，PLAG1基因获得628 bp片段（图1，图2）。PLAG1基因的628 bp DNA片段包含位于3'UTR的AC_000171.1:g.48308C>T单核苷酸多态性（SNP），使用SacII限制性内切酶进行鉴定。PLAG1/SacII多态性鉴定出C和T两个等位基因。CC基因型表现为106 bp和522 bp两个限制性片段，表明完全消化。TT基因型显示单一的628 bp片段，表明缺乏SacII限制性位点。杂合子CT个体则呈现106 bp、522 bp和628 bp三个片段（图2），证实了双等位基因的存在。

类似地，IGF-1R基因的604 bp DNA片段包含位于第12外显子的JQ924783.1:g.269418A>G SNP，使用MspI限制性内切酶进行分析。该位点的腺嘌呤（A）向鸟嘌呤（G）的转换导致了脯氨酸的同义密码子改变（CCA → CCG）。尽管不改变氨基酸序列，但同义突变可能通过影响mRNA剪接、稳定性或翻译效率来显著调节基因表达。在本研究的马都拉牛中，IGF-1R/MspI片段检测到A和G两个等位基因：AA基因型产生一个604 bp片段，GG基因型产生239 bp和365 bp两个片段，AG基因型则产生239 bp、365 bp和604 bp三个片段（图1），证实了杂合性。

马都拉牛PLAG1/SacII和IGF-1R/MspI多态性的等位基因和基因型频率见表2和表3。两个位点均分离出三种基因型和两个等位基因（PLAG1为C和T，IGF-1R为A和G），表明群体中存在遗传变异。根据Nei和Kumar以及Allendorf等人的标准，若一个位点存在多于一个等位基因且最常见等位基因频率低于0.99，则认为该群体是多态性的。基于此标准，马都拉牛群体中的两个位点均为多态性。对于PLAG1/SacII位点，C等位基因频率显著高于T等位基因，TT基因型频率低于CT和CC基因型。对于IGF-1R/MspI位点，G等位基因频率显著高于A等位基因，AA基因型频率最低。

多态性也可通过杂合度值评估。如表2和表3所示，两个位点的观测杂合度（Ho）均未超过0.5。Allendorf等人将杂合度超过0.5的群体归类为高度多态性。本研究中，PLAG1/SacII位点的观测杂合度（Ho）低于期望杂合度（He），表明杂合子缺失，可能源于马都拉牛中针对PLAG1基因的近交或高强度选择压力。相反，对于IGF-1R/MspI位点，观测杂合度（Ho）高于期望杂合度（He），表明该群体未受到该基因的强选择压力，可能正在进行随机交配。

卡方（χ²）检验结果显示，PLAG1和IGF-1R两个位点的基因型分布均显著偏离哈迪-温伯格平衡（χ²计算值 > χ²临界值0.05），见表2和表3。根据Allendorf等人的观点，当等位基因和基因型频率在世代间保持恒定，且χ²值低于临界值时，群体处于哈迪-温伯格平衡。观察到的偏离表明非随机交配、选择、遗传漂变、近交、突变或迁移可能正在影响该群体的基因频率。这些发现为了解马都拉牛群体的遗传结构提供了宝贵信息，并突显了遗传监测在维持多样性和指导育种策略方面的重要性。

PLAG1多态性与不同时期体重和体型性状的关联

PLAG1基因AC_000171.1:g.48308C>T SNP与马都拉牛不同生长阶段生长性状的关联见表4。在出生时，该SNP与体重观察到统计学显著关联（p = 0.019）。值得注意的是，TT基因型个体的平均出生体重（22.23 ± 4.27 kg）最高，高于CT和CC基因型个体。相应的95%置信区间表明，TT组的置信区间下限始终高于其他基因型，强化了这种差异的程度。在使用错误发现率（FDR）方法控制多重比较后，此关联仍然显著（p_adj < 0.05），表明这是一种不太可能由偶然因素造成的稳健关联。假设检验显示，出生体重的残差符合方差齐性（Levene检验 p > 0.05），但略微偏离正态性（Shapiro–Wilk检验 p < 0.05），表明结果应谨慎解读，尽管ANOVA通常对轻微的正态性偏离具有稳健性。这表明T等位基因可能通过PLAG1表达相关的调控机制对早期出生后生长产生积极影响。这些发现支持了PLAG1位点的遗传变异导致出生时体重表型变异的假设，可用于旨在提高马都拉牛早期生长性能的育种计划。虽然PLAG1的SNP与出生体重显著相关，但其在出生时对其他体型性状（如体长、体高、胸围）的影响无统计学意义（p > 0.05）。

在断奶年龄，未观察到基因型与任何测量性状之间的显著关联（p > 0.05）。然而，TT基因型个体倾向于表现出更高的平均体重和更大的体型尺寸，表明在中间生长阶段可能存在非显著的遗传优势趋势。到一岁龄时，该SNP的遗传效应变得更加明显。发现基因型与体重（p = 0.035）和体高（p = 0.017）存在显著关联，TT和CT个体的生长性能优于CC个体。这些结果表明，AC_000171.1:g.48308C>T多态性可能随时间产生累积效应，有助于在后期生长阶段增强肌肉和骨骼发育。这一模式与先前在牛中的研究一致，其中PLAG1基因座附近的多态性与荷斯坦-弗里斯兰牛的早期生命体重和青春期前后生长密切相关。类似地，在巴厘牛中，相同的SNP（AC_000171.1:g.48308C>T）与增加的体长和骨架大小显著相关。这种跨品种的一致性强化了PLAG1多态性作为标记辅助选择（MAS）计划中稳健分子标记的效用，旨在改善肉牛群体的生长和结构性状。

IGF-1R多态性与不同时期体重和体型性状的关联

IGF-1R基因JQ924783.1:g.269418A>G SNP与马都拉牛不同发育阶段生长性状的关联性评估结果总结于表5。在出生时，未观察到基因型与任何测量性状（包括体重、体长、体高和胸围）之间的显著关联（原始p > 0.05；校正后p > 0.05）。所有基因型的95%置信区间显示重叠范围，进一步表明在新生儿阶段缺乏有意义的差异。假设检验确认残差通常符合方差齐性要求（Levene检验 p > 0.05），尽管某些性状偏离正态性（Shapiro–Wilk检验 p < 0.05），表明尽管ANOVA对中等程度的正态性偏离具有稳健性，结果仍应谨慎解读。这些发现表明，该IGF-1R多态性在新生儿生长阶段未产生可检测的表型效应。

在断奶年龄，检测到基因型与体长之间存在显著关联（原始p = 0.037；FDR校正后p < 0.05）。AA基因型动物表现出最大的平均体长（107.40 ± 10.5 cm），其95% CI的下限超过了AG和GG基因型，表明一致的表型优势。这种模式提示A等位基因可能通过调节IGF-1受体介导的生长信号通路，在此中间生长阶段对线性骨骼生长做出积极贡献。断奶时的其他体型性状未显示统计学显著关联（原始和校正后p均 > 0.05），表明该多态性在此阶段的影响可能是性状特异性的。

到一岁龄时，基因型与体高之间出现了显著关联（p = 0.024）。AG（111.54 ± 8.16 cm）和GG（113.74 ± 6.73 cm）基因型动物的体高显著大于AA基因型（102.85 ± 4.18 cm）动物。这表明G等位基因在生长后期阶段对骨架发育可能具有加性或显性效应。这些发现提示IGF-1R JQ924783.1:g.269418A>G多态性存在阶段特异性效应，其中G等位基因似乎在后期生长阶段对骨骼发育的贡献更为显著。这一趋势与先前张等人对中国南阳牛以及Szewczuk等人对安格斯牛的研究报道一致，这些研究报道了IGF-1R基因型与各种生长参数，特别是在高级生长阶段的体长和体高之间存在显著关联。总的来说，这些结果突显了IGF-1R基因作为改善生长相关性状，特别是与骨骼结构相关性状的候选遗传标记的潜力。这使得IGF-1R成为标记辅助选择（MAS）计划中有价值的目标，旨在增强如马都拉品种等肉牛的结构和生长性能。

结论

PLAG1基因的AC_000171.1:g.48308C>T SNP与马都拉牛出生和一岁时的体重及体高相关，表明其对早期和后期生长性能的潜在影响。类似地，IGF-1R基因中的JQ924783.1:g.269418A>G SNP与马都拉牛断奶期和一岁时的体长及体高相关，提示其在关键生长阶段对骨骼发育的作用。这一发现为基于体型性状选择马都拉牛提供了遗传基础，并支持标记辅助选择（MAS）策略的实施。MAS提供了比传统表型选择更高效、更有针对性的替代方案，能够早期识别与生长性能相关的理想遗传谱系。然而，为了增强这些发现的可靠性和适用性，建议在更大、更多样化的马都拉牛群体中进行进一步验证。此类研究将有助于确认这些关联，并加强这些SNP作为旨在提高生产力和结构体型的牛育种计划中稳健遗传标记的潜力。