Abstract抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体通常在类风湿关节炎（RA）发病前出现，但部分患者可在疾病发病后出现血清阳转。本研究旨在分析与抗CCP抗体血清阳转相关的因素。研究连续入组了56例抗CCP抗体阴性的RA患者。将首次检测抗CCP抗体状态的时间点定义为基线。随后，在平均间隔77（±41）个月后重新评估抗CCP抗体状态。研究人员比较了发生与未发生抗CCP抗体血清阳转患者的人口统计学和基线特征。此外，还对相关研究进行了系统回顾。结果显示，56例患者中有6例（11%）经历了抗CCP抗体血清阳转（抗体水平从<4.5 U/mL转为12.4 [8.5–65.7] U/mL）。这些患者更可能患有间质性肺病（ILD）、携带HLA-DRB1共享表位（SE）等位基因以及使用生物类改善病情抗风湿药（bDMARDs）。通过系统回顾和荟萃分析，确定bDMARDs使用、骨侵蚀、HLA-DRB1 SE和类风湿因子（RF）阳性是与抗CCP抗体血清阳转相关的因素。通过选择性筛选抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）反应，观察到RA发病后抗体谱的扩增。RA发病后抗CCP抗体的血清阳转与RA的典型特征相关，因此可能代表一种被忽视的血清阳性疾病。1. Introduction类风湿关节炎（RA）是一种炎症性关节自身免疫性疾病，其特征是产生针对免疫球蛋白G和/或翻译后修饰蛋白（特别是瓜氨酸化蛋白）的自身抗体，并导致进行性关节破坏。通常认为RA发病前即已产生这些自身抗体，或者疾病在其缺失（即所谓血清阴性RA）的情况下发生。抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）的产生可由关节外部位（如肺部、口腔和肠道）的刺激引发。肺部暴露于有害物质、牙周炎和肠道菌群失调可能诱导瓜氨酸化自身蛋白成为“新自身”抗原并被免疫系统识别。随后，ACPA发生表位扩展和滴度升高，若存在HLA-DRB1共享表位（SE），此过程可能进一步增强。然而，在一系列自身免疫发展过程中，关节炎症何时以及如何被引发仍不清楚。近期研究表明，部分RA患者的ACPA在疾病发病后出现阳性血清转。本研究假设，自身抗体的成熟过程持续至关节炎发作之后，而ACPA的血清阳转代表了成熟过程的早期阶段，是一种被忽视的血清阳性疾病。为验证此假设，研究人员随访了在首次检测时抗CCP抗体为阴性的RA患者的自身抗体谱，并分析与抗CCP抗体血清阳转相关的因素。此外，还进行了包括荟萃分析在内的系统性文献回顾，以将本病例对照研究结果与既往研究进行比较。2. Methods2.1. Study design本研究为一项在北海道大学医院进行的单中心回顾性观察性研究，并获得当地伦理委员会批准。所有研究人员均遵守《赫尔辛基宣言》和《涉及人体受试者的医学研究伦理指南》。所有参与者均签署了书面知情同意书。2.2. Participants参与者年龄≥18岁，符合1987年美国风湿病协会（ACR）或2010年ACR/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）的RA分类标准，并且在首次检测时抗CCP抗体为阴性。2.3. Primary endpoint在研究参与者中，至少间隔三个月后重新评估抗CCP抗体。第二次检测时抗CCP抗体阳性被定义为抗CCP抗体血清阳转。2.4. Autoantibody detection and HLA-DRB1 genotyping通过ELISA或化学发光酶免疫法（CLEIA）检测患者血清中的抗CCP抗体（CCP2）。通过ELISA检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体。通过PCR-测序分型法对HLA-DRB1进行基因分型，并将特定等位基因定义为SE编码等位基因。2.5. Selective screening for ACPA responses使用含有337种不同环瓜氨酸肽及其对应精氨酸变体的微阵列芯片，与患者血清（按1:500, 1:100和1:20稀释）共同孵育，然后进行二级抗体和对照抗体染色，并使用微阵列扫描仪进行读值分析，以筛选ACPA反应。2.6. Literature search and data extraction为确定抗CCP抗体是否在RA发病后出现阳性血清转，研究人员系统检索了PubMed、Cochrane Library和Scopus数据库。两位作者独立根据排除标准（无法评估抗CCP血清阳转频率、综述/荟萃分析/研究方案、会议摘要）剔除不相关报告，最终筛选出14项相关研究。收集的数据包括患者纳入标准、RA分类标准、患者总数、年龄、性别、随访时间、治疗、基线时抗CCP阴性患者数以及经历抗CCP血清阳转的患者数。并在选定研究中二次分析与抗CCP血清阳转相关的因素。2.7. Meta-analysis对系统回顾中包含的14项研究中统计分析了RA发病后抗CCP血清阳转相关因素的两项研究，以及本病例对照研究进行了定量综合。结果以分类变量的比值比（OR）和连续变量的均数差（MD）及其95%置信区间表示。采用I²和Q检验分析异质性。采用DerSimonian-Laird（随机效应）法计算合并OR值。采用漏斗图评估发表偏倚。2.8. A historical cohort comprising patients who were positive for anti-CCP at its first determination另纳入一个历史队列，包含在首次检测时抗CCP抗体即为阳性、于2010年1月至2019年6月期间就诊于北海道大学医院的成年RA患者。2.9. Statistical analysis连续变量以均数（±标准差）或中位数[范围]表示，并使用相应检验进行比较。分类变量以数字（百分比）表示，并使用卡方检验或Fisher精确检验进行比较。显著性水平定义为p值小于0.05。3. Results3.1. Patient characteristics本研究共纳入56例患者。基线时，大多数参与者处于RA早期，诊断至基线的中位病程<0.5年。63%的参与者处于Steinbrocker I期，52%在基线时未使用过改善病情抗风湿药（DMARD）。19%的患者在基线时存在间质性肺病（ILD）。3.2. Comparison of patients with and without anti-CCP seroconversion在平均间隔77（±41）个月后重新评估抗CCP抗体，56例患者中有6例（11%）经历了抗CCP抗体血清阳转。这6例患者中，有2例同时出现RF血清阳转，另有2例显示RF滴度显著升高。发生与未发生血清阳转患者的两组间，抗CCP抗体两次检测的间隔时间无差异。与未发生血清阳转的患者相比，发生血清阳转的患者更可能年龄较大、患有ILD、携带HLA-DRB1 SE等位基因以及使用bDMARDs。3.3. Systematic literature review and meta-analysis系统回顾了14项相关研究。在专注于RA的研究中，抗CCP血清阳转率平均为8.5%，高于报告混合性关节病的研究（平均2.3%）。除bDMARDs使用、高龄、HLA-DRB1 SE和ILD外，还发现高Sharp/van der Heijde评分、早期疾病、关节液抗CCP抗体、骨侵蚀、RF阳性与抗CCP血清阳转相关。与本病例对照研究类似，有两项研究统计分析了RA发病后抗CCP血清阳转的相关因素。对这三项研究的荟萃分析表明，bDMARDs使用、骨侵蚀、HLA-DRB1 SE和RF阳性是抗CCP血清阳转的共同相关因素。3.4. ACPA profiles over time in anti-CCP seroconverted patients对研究中两名抗CCP血清阳转患者（有配对血清样本可用）随时间变化的ACPA谱进行分析发现，在一名65岁女性患者（患有ILD，携带一个HLA-DRB1 SE等位基因，接受阿巴西普单药治疗）中，RA发病后抗体谱出现扩展，特别是对瓜氨酸化纤维蛋白原和葡萄糖-6-磷酸的反应在随访时更强。与此一致，该患者的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体滴度随时间升高。相反，在另一名70岁女性患者（患有ILD，携带两个HLA-DRB1 SE等位基因，接受阿巴西普单药治疗）中，仅观察到抗体结合谱的微小改变，其抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体滴度随时间下降。这两名患者的临床病程提示抗体谱扩展与治疗反应之间可能相互独立。3.5. Comparison of study participants with patients who were positive for anti-CCP at its first determination使用历史队列进行的补充分析表明，与抗CCP抗体持续阴性的患者相比，发生抗CCP血清阳转的患者和在首次检测时即呈阳性的患者共享一些临床特征，如bDMARDs使用、侵蚀性疾病、ILD和RF阳性。4. Discussion本研究首次发现HLA-DRB1 SE和ILD是RA发病后抗CCP抗体血清阳转的相关因素。鉴于这两个因素与RA的抗体血清阳性状态相关，并且系统回顾和荟萃分析指出了bDMARDs使用、骨侵蚀和RF阳性也是相关因素，抗CCP血清阳转可能代表一种被忽视的血清阳性疾病，提示依赖单次抗CCP检测可能存在局限性。在RA的发生和发展中，关节炎症通常被认为先于自身抗体的产生。然而，在某些患者中，关节炎的发展可能先于自身抗体。RA关节的滑膜组织和滑液中富含瓜氨酸化蛋白，软骨下骨髓和滑膜中形成三级淋巴结构，活化的滑膜成纤维细胞通过波形蛋白的瓜氨酸化及其与MHC II类分子的相互作用促进自身免疫。这些发现表明，关节内的炎症状态是RA自身免疫反应的启动者或放大器。对RA患者未患病亲属的纵向研究表明，ACPA谱随时间的变化可以是多样的。本研究结果提示，表位扩展也可能在RA发病后发生，代表了ACPA谱改变的另一种情况。在ACPA发展过程中，遗传和环境因素在不同阶段可能扮演不同角色。HLA-DRB1 SE可能在ACPA发展的成熟阶段起关键作用。本研究显示的抗CCP血清阳转与HLA-DRB1 SE之间的关联表明，抗CCP血清阳转可能与识别CCP2所需的ACPA成熟水平有关。鉴于bDMARDs使用和侵蚀性疾病作为抗CCP血清阳转的相关因素，发生血清阳转的患者可能比未发生者具有更高的疾病活动度和更差的预后。但本研究未能证实此假设。关于抗CCP血清阳转与年龄的关系，本研究结果与既往研究不一致甚至相反，荟萃分析也未能就此得出明确结论。ACPA阳性和阴性RA可能具有不同的遗传背景。虽然当前指南未针对这两种亚型推荐不同的治疗策略，但血清状态仍可能影响日常临床实践中的治疗决策。在此背景下，将重新评估抗CCP抗体及其血清阳转纳入达标治疗策略可能会提供额外的临床见解。需要注意的是，本病例对照研究是单中心回顾性观察性研究，证据有限。由于样本量小，无法通过多变量分析确认结果。此外，抗CCP抗体两次检测间隔时间较长，且缺乏第三次检测，难以排除间歇性阳性的可能。系统文献回顾部分弥补了这些局限性。总之，部分RA患者发病后可能出现抗CCP抗体阳性血清转，这与bDMARDs使用、侵蚀性疾病、HLA-DRB1 SE、ILD和RF阳性等RA典型特征相关。本研究首次确定了HLA-DRB1 SE和ILD对抗CCP血清阳转的影响。RA发病后抗CCP抗体的血清阳转可能代表一种被忽视的血清阳性疾病，提示在临床实践中仅依赖单次抗CCP检测结果的价值可能有限。
