自闭症谱系障碍R451C-Neuroligin 3小鼠模型背侧纹状体中I型代谢型谷氨酸受体功能受损的机制研究

本文深入探讨了R451C-NL3基因突变小鼠模型中背侧纹状体依赖的ASD样行为及突触功能障碍。研究通过多学科方法揭示了mGlu5受体表达和功能受损是导致 corticostriatal 长时程突触可塑性（LTP/LTD）缺陷的核心机制，并发现外源性激活CB1受体可部分挽救DHPG诱导的LTD。该研究为理解ASD的突触病理机制提供了重要证据，并指出mGluI受体信号通路作为潜在治疗靶点的重要意义。

2 Materials and Methods

2.1 Experimental Model

研究使用成年（P60–P90）R451C-NL3基因敲入雄性小鼠（B6;129-Nlgn3tm1Sud/J）及其野生型（WT）同窝小鼠。NL3基因位于X染色体，ASD病例中男性患病率是女性的4倍，因此本研究选用雄性半合子小鼠。所有实验均经IRCCS Fondazione Santa Lucia伦理委员会批准，并获意大利卫生部授权（nr. 492/2019 and 739/2022），符合意大利D. Lgs 26/2014和欧盟指令2010/63/EU。所有努力均用于最小化动物数量及痛苦。小鼠每笼4只饲养，自由获取食物和水，12/12小时光暗循环，恒定温度（22°C ± 2°C）。基因型通过PCR检测NL3基因中第一个loxP插入位点进行鉴定。

2.2 Behavioral Assays

两个月大的R451C-NL3小鼠（N=23）和同龄WT同窝小鼠（N=22）用于行为学分析。小鼠在测试前接受一周的每日一次操作适应。之后进行一系列行为测试，每次测试在不同日期进行，顺序随机，但三室社交测试因需隔离期始终在最后进行。行为分析采用研究领域标准（RDoC）框架。

2.2.1 Three-Chamber Social Interaction Test

三室测试用于研究社交能力和社交新颖性。装置为分为三个相同室的矩形有机玻璃箱（60×40×22 cm）。测试前动物隔离并在装置中适应1小时。实验开始时将测试鼠置于中央室，自由探索10分钟（适应）。之后，在社交性阶段，一室铁丝杯内放置无生命物体，另一室放置同龄陌生WT雄性鼠；测试鼠选择与其中之一互动。10分钟后，清洁 chambers，进入社交新颖性阶段（10分钟），重新引入陌生鼠，另一室以新陌生鼠替换物体。每次会话用数码摄像机记录，使用Ethovision XT 16分析。社交指数评估对同种（S）相对于物体（O）的偏好，社交新颖性指数评估对新（N）相对于熟悉（F）同种的偏好。

2.2.2 Sucrose Splash Test

蔗糖溅射测试用于调查快感缺乏和动机行为。测试前动物适应1小时。然后将其置于标准有机玻璃笼（15×30×20 cm），红光照明下向背部皮毛喷洒两次10%蔗糖溶液。记录5分钟内理毛行为的延迟起始和总持续时间，使用Ethovision XT 16自动视频跟踪技术。

2.2.3 Novel Object Recognition Test

新物体识别测试（NORT）是评估啮齿类识别记忆的有效测试，利用其探索新物体的自然倾向。实验场地为48×48×24.5 cm有机玻璃方箱。测试协议包括三个会话：适应、训练（S1）和测试 trial（S2），各5分钟。适应与训练间隔3分钟，S1与S2间隔1小时。适应阶段小鼠探索空室；S1会话暴露于两个相同物体；S2会话将一个熟悉物体替换为新物体。分析包括总探索时间（测试阶段探索新（TN）和熟悉（TF）物体的时间）和辨别指数（DI = (TN—TF)/(TN+TF)）。每次试验后场地用10%乙醇清洁以减少嗅觉线索。小鼠运动使用Ethovision XT16记录跟踪。

2.2.4 Y-Maze Test

Y迷宫测试用于评估自发交替行为和空间工作记忆。装置为白色丙烯酸塑料，三个相同臂（8×30×15 cm），120°夹角。入口臂门口安装T型断头门防止小鼠退出。当被试四肢进入一臂时计为一次进入。每次试验10分钟，使用Ethovision XT 16记录分析。空间工作记忆性能通过计算三联体（ABC, BCA, CAB）交替百分比相对于总进入次数来量化。同时记录总进入次数以评估探索行为。

2.2.5 Open Field Test

开放场测试（OF）在圆形场地（60 cm直径）进行30分钟观察，测量自发运动活动。特别关注小鼠在距墙5 cm定义的中央区域的标准化行走距离。数据采集和分析使用Ethovision XT 16。分析参数包括运动活动（总行走距离）、速度、在中心时间、进入中心次数和排便次数。

2.2.6 Self-Grooming Behavior

在自发开放场活动的前10分钟，额外检查自我理毛行为，评分理毛事件总数（定义为清洁和摩擦面部和口鼻、舔和抚摸侧腹和腹部、肛周区和尾巴的完整序列）和总理毛时间。

2.2.7 Elevated Plus-Maze Test

高架十字迷宫（EPM）测试用于评估焦虑样行为。装置为木结构，含两个开放臂（35×6 cm）和两个封闭臂（35×6×20 cm），从中央平台辐射。迷宫高出地面100 cm。每只鼠单独置于中央平台，自由探索5分钟。视频记录用天花板安装相机获取，Ethovision XT 16分析。评分进入开放和封闭臂的次数和潜伏期（以四爪进入定义）以测量焦虑水平。

2.2.8 Marble Burying Test

埋珠测试用于评估重复和强迫行为。小鼠单独饲养于标准聚碳酸酯笼（26×48×20 cm），垫料5 cm深。二十颗珠子整齐置于垫料表面。测试30分钟期间每5分钟对垫料表面拍照，以更好量化埋珠数。珠子若四分之三被垫料覆盖则计为埋藏。

2.2.9 Accelerating Rotarod Test

加速旋转棒测试用于评估协调和运动学习。实验协议包括三个训练会话和一个测试会话，连续四天进行。使用电子控制计算机化系统（Panlab, Harvard Apparatus），含旋转圆柱和四个通道（3 cm直径）。每只动物置于一通道。第一天，小鼠在4 rpm恒定速度适应30秒。然后旋转速度从4线性加速至40 rpm，300秒完成。每会话三次试验，间隔5分钟。测量参数：跌落延迟（秒）；跌落前达到的最大旋转速度（rpm）；测试最后一天的最佳表现（最大跌落延迟）。线性回归分析用于从每只鼠数据集中导出两个关键参数：截距作为初始运动协调的估计，斜率作为学习率的代理。

2.3 Slice Preparation and Electrophysiology Recordings

44只雄性R451C-NL3小鼠和40只野生型同窝小鼠（P60–P70）通过颈椎脱位处死。 corticostriatal切片（细胞内记录300 μm，膜片钳记录220 μm）用振动切片机在氧合人工脑脊液（ACSF; Krebs'溶液，单位mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO4, 2.4 CaCl₂, 10 glucose, 18 NaHCO₃）中切割。单切片转移至记录室（0.5–1 mL体积），以恒定温度（32°C–33°C）和流速（2–3 mL/min）灌注氧合ACSF。常规细胞内记录用充有2 M KCl（40–60 MΩ）的尖锐微电极盲法进行。信号用Axoclamp 2B放大器和pClamp9软件采集。记录神经元根据电生理特性鉴定为棘状投射神经元（SPNs）。谷氨酸能兴奋性突触后电位（EPSPs）通过放置在皮质V–VI层的双极电极诱发，灌注液中存在GABA_A受体拮抗剂荷包牡丹碱（PTX, 50 μM）。刺激频率0.05 Hz，持续时间30 μs，强度诱发70%最大EPSP振幅。高频刺激（HFS）由三个超阈值强度 train（100 Hz频率，3 s持续时间，20 s间隔）组成，用于诱导 corticostriatal 突触的长时程可塑性。ACSF中省略镁以移除NMDA受体阻断并优化长时程增强（LTP）的诱导。HFS后连续记录EPSP振幅25至40分钟，绘制为HFS前平均对照EPSP振幅的百分比。全细胞配置下进行膜片钳记录。纹状体SPNs使用BX51WI显微镜（Olympus）可视化，采用微分干涉对比和标准红外光学（IR-DIC），并根据形态和电生理特性鉴定。电生理信号用Multiclamp 700B放大器耦合pClamp 10.6软件检测。电压和电流钳记录用硼硅玻璃电极（电阻5–10 MΩ）进行，内液含（单位mM）：125 K⁺-葡萄糖酸盐, 10 NaCl, 1 CaCl₂, 2 MgCl₂, 0.1 BAPTA, 19 HEPES, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP; pH 7.35; 300 mOsm。若串联电阻超出5–30 MΩ范围或变化>20%则丢弃记录。对于mGluI受体诱导的长时程抑制（DHPG-LTD）实验，SPNs在-50 mV保持电位钳制，在50 μM PTX存在下记录。对于NMDA电流记录，SPNs在-70 mV保持电位钳制，在河豚毒素（TTX, 1 μM）加PTX存在下记录。为计算NMDA/AMPA比率，记录电极充有内液（单位mM）：120 CsMeSO₃, 15 CsCl, 8 NaCl, 10 TEA-Cl, 2–5 QX-314, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 2 Mg-ATP, and 0.3 NaGTP; pH用CsOH调至7.3; 300 mOsm。兴奋性突触后电流（EPSCs）最初在-70 mV保持电位记录，PTX存在下。然后保持电位调至+40 mV，在PTX加AMPA受体拮抗剂CNQX（10 μM）存在下测量NMDA介导的EPSCs。药物通过切换灌注液至含药溶液使用三通注射器浴应用。

2.4 Western Blot

纹状体裂解物的Western blot如前所述进行。从10只R451C-NL3小鼠和 respective 8只WT同窝小鼠通过颈椎脱位处死收集背侧纹状体。样品在冷提取缓冲液中匀浆：50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.25% Na脱氧胆酸盐, 5 mM MgCl₂, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1%蛋白酶抑制剂混合物。之后样品超声处理，冰上放置1小时，离心（13,000 rpm, 15 min, 4°C）。蛋白含量用Bradford assay定量。DTT和NuPage LDS样品缓冲液加入蛋白提取物，纹状体裂解物变性（95°C, 5 min）后上样到8%–10% SDS-PAGE胶。胶转印到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，然后4°C overnight与以下一抗孵育：兔抗mGlu1受体（1:1000）, 兔抗mGlu5受体（1:5000）, 兔抗NMDA受体亚基2A（GluN2A）（1:1000）, 兔抗NMDA受体亚基2B（GluN2B）（1:1000）, 兔抗AMPA受体亚基1（GluA1）（1:1000）, 兔抗AMPA受体亚基2（GluA2）（1:1000）, 兔抗SHANK3（1:1000）, 鼠抗PSD95（1:20000）, and 兔抗NL3（1:8000）。鼠抗β actin（1:10,000）室温孵育1小时。使用抗鼠和抗兔辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗。使用EveryBlot Blocking Buffer和Tris–HCl洗涤缓冲液。免疫检测用ECL Prime Cytiva试剂和iBright CL1000仪器进行。用ImageJ软件定量。

2.5 Preparation and Western Blot Analysis of Synaptic Plasma Membranes

突触体从8只三个月大对照（WT）和10只R451C-NL3小鼠的背侧纹状体制备，颈椎脱位处死。冷冻脑样品冰上解冻，称重，在10%（w/v）0.32 M蔗糖缓冲液中匀浆，含EDTA (1 mM), Tris–HCl (10 mM, pH 7.4), PMSF (0.5 mM), and蛋白酶抑制剂混合物。匀浆液离心10分钟，1000×g（4°C）分离核 pellet。上清液然后离心30分钟，18000×g（4°C），所得 pellet 重悬于0.32 M蔗糖缓冲液，铺在 discontinuous蔗糖梯度（0.8, 1.0, 1.2 M）上，离心2小时，75000×g（4°C）。突触质膜组分 stratified在1/1.2 M蔗糖界面。回收的突触体用冷蔗糖缓冲液1:2稀释，离心1小时，40000×g（4°C）。Pellets重悬于Hepes缓冲液（0.5 mM PMSF, 10 mM Hepes, and蛋白酶抑制剂混合物; pH 7.4）。取5 μL悬液用于BCA法测定蛋白含量，其余-80°C保存直至使用。Western Blot分析，10 μg WT和R451C-NL3样品蛋白在样品缓冲液（2X）中37°C变性5分钟，7.5% SDS-聚丙烯酰胺胶分离，转印到硝酸纤维素膜。滤膜用Western Breeze Chemiluminescent Immunodetection System kit处理。简要而言，滤膜用封闭液封闭30分钟，overnight与以下一抗孵育：抗mGlu5受体（兔1:2000）, 抗mGlu1α（鼠, 1:1000）, 抗NL3（兔1:1000）, and抗β-actin（鼠1:1000）。使用碱性磷酸酶偶联抗兔或抗鼠二抗。化学发光用VersaDoc 4000 Imaging System检测定量。检测后，与抗β-actin抗体孵育的膜洗涤后与抗Homer pan抗体（兔1:1000）孵育。洗涤后，膜与指定二抗孵育，然后如前所述检测信号并定量。

2.6 Statistical Analysis

电生理和生化实验的受试者数量基于先前研究确定。行为实验样本量用GPower 3.1计算（t检验；两个独立均值差异；先验功效分析—计算所需样本量；效应大小d=0.875；α错误概率=0.05；功效=0.8）。行为和生化实验盲法分析基因型；电生理实验盲法执行和分析实验变量。电生理实验分析离线使用Clampfit 10软件。统计分析用Prism软件进行。数据分布正态性用Shapiro–Wilk检验调查。使用ROUT方法识别可能异常值，未排除数据。对于参数数据的单比较，使用配对或非配对t检验，而非参数数据用Mann–Whitney检验分析。单因素ANOVA后Sidak多重比较检验用于分析正态分布的多数据集。双因素ANOVA后Sidak多重比较检验用于开放场和旋转棒测试的时间过程分析以及三室测试中的交互时间比较。多重t检验后FDR多重比较校正用于比较埋珠测试数据。统计显著性设定为p<0.05。数据表示为均值±标准误（SEM）。对于电生理，每个细胞记录自不同脑切片。生物重复数用N表示动物，n表示细胞。

3 Results

3.1 The R451C Mutation in the Neuroligin 3 Gene Induces Dorsal Striatum-Dependent ASD-Like Behaviors in Mice

本研究对R451C-NL3小鼠进行了背侧纹状体依赖的刻板和运动行为的全面行为学分析。

首先，通过评估开放场测试中自发活动中的自我理毛来评估R451C-NL3小鼠的重复行为。正常理毛行为涉及持续数秒至数分钟的短暂抓挠和用前肢清洁皮毛。我们观察到R451C-NL3小鼠完整自我理毛序列的次数和持续时间显著增加，表明突变体表达了刻板行为。

然后，首次在R451C-NL3小鼠模型中使用埋珠测试，这是研究啮齿类刻板行为的 consolidated测试。有趣的是，该测试突出了突变体相对于WT小鼠的挖掘和埋藏行为显著增加，进一步支持了重复行为的增加。具体而言，多重t检验分析后FDR多重比较校正显示，在观察期间的每个时间间隔，R451C-NL3埋藏的珠子数显著高于对照小鼠。总体而言，在整个测试期间，R451C-NL3小鼠埋藏的珠子数显著多于WT同窝小鼠。

然后研究了同样基于背侧纹状体的运动行为。首先用加速旋转棒测试检查运动协调和学习，该任务需要形成和巩固重复运动 routine。在训练会话中，突变体和对照小鼠的表现类似改善。线性回归分析未检测到基因型在初始协调或学习率上的显著差异。然而，R451C-NL3小鼠在最后一天（第4天）表现出显著更好的性能，表明重复运动 routine的巩固更高效。

为确定总体运动活动水平，进行了开放场测试。R451C-NL3小鼠显示总水平行走距离显著增加，以及在会话最后两个时间间隔的水平行走距离增加，表明多动行为。然而，开放场测试中检测到的平均速度在两种基因型间无显著差异，表明R451C-NL3小鼠运动活动增加可能是由纹状体回路损伤影响设定目标、维持方向和遵循平滑轨迹的能力引起。

为进一步验证R451C-NL3小鼠作为可靠ASD模型，还用三室测试评估了社交行为。在社交性会话期间，突变小鼠对社交 versus非社交刺激无偏好，社交偏好指数降低。类似地，在随后的社交新颖性会话中，R451C-NL3小鼠在与熟悉或新鼠互动时间上无差异。因此，R451C-NL3小鼠显示新偏好指数降低。

此外，发现携带R451C-NL3突变的小鼠在蔗糖溅射测试中显示自我理毛活动减少，表明动机降低。因此，在新物体识别和Y迷宫测试中未发现认知功能显著改变。类似地，在开放场和高架十字迷宫测试中未观察到R451C-NL3小鼠焦虑相关行为的变化。

3.2 The R451C Mutation Impairs the Expression of Corticostriatal Bidirectional Synaptic Plasticity

Corticostriatal突触表达不同形式的长时程双向可塑性，即增强（LTP）和抑制（LTD），可通过传入纤维高频刺激（HFS）或激动剂诱导的mGluI受体激活实验诱导。如我们先前所示，在携带ASD相关R451C突变的neuroligin3（NL3）基因小鼠的背侧纹状体中，皮质纹状体长时程突触抑制受损。因此，我们研究了在R451C-NL3纹状体中其他形式的长时程突触可性的表达。我们发现活动依赖的长时程增强（HFS-LTP）在R451C-NL3背侧纹状体中也受损。事实上，在R451C-NL3切片中交付诱导协议未能诱导出与WT中观察到的增强幅度相似的LTP。

然后我们检查了R451C-NL3纹状体中mGluI依赖的药理学LTD表达。浴应用50 μM (RS)-3,5-二羟基苯基甘氨酸（DHPG; 10分钟）导致WT切片中兴奋性突触后电流（EPSCs）的持续LTD。相反，相同协议在R451C-NL3切片中仅诱导EPSC振幅的瞬时 decrease，然后恢复到与基线无显著差异的水平。

这些数据证明在R451C-NL3小鼠的背侧纹状体中，不同形式的长时程突触可塑性整体受损，包括活动依赖和药理学诱导的。

3.3 Exogenous Activation of CB1 Receptors Rescues the Expression of mGluI-Induced LTD.

我们先前表明，内源性大麻素（eCB）信号系统的激活能够部分挽救R451C-NL3 corticostriatal切片中的HFS-LTD。因此，我们研究了eCB系统的外源性激活是否也能挽救DHPG应用诱导的药理学LTD。突变和WT小鼠的corticostriatal切片与高选择性CB1受体（CB1R）激动剂ACEA（20 μM）预孵育。在WT切片中，ACEA存在下DHPG应用诱导了LTD，其幅度与对照条件下记录的DHPG-LTD相似。ACEA预孵育未改变DHPG诱导LTD幅度的观察表明，mGluI受体激活能够诱导足够的CB1R激活以在WT切片中诱导这种形式的corticostriatal LTD。事实上，mGluI受体通过不同信号通路，包括eCB生产，在调节兴奋性谷氨酸能突触的可塑性中起关键作用。相反，在R451C-NL3切片中，外源性CB1R激活相对于DHPG具有 additive效应，因为与ACEA预孵育能够完全挽救DHPG-LTD的表达，其幅度与WT切片中记录的药理学LTD相当。与这些观察一致，DHPG-LTD表达被切片与CB1R特异性拮抗剂AM-251预孵育阻止，在两种基因型中仅观察到轻微的突触传递抑制。

总体而言，这些数据表明在R451C-NL3切片中，DHPG-LTD deficit可能取决于mGluI受体诱导eCB生产的能力。在R451C-NL3切片中mGluI受体激动剂DHPG仅诱导EPSC振幅的瞬时抑制，以及用CB1R激动剂ACEA挽救药理学LTD的观察支持这一假设。

3.4 Activation of mGluI Receptors Does Not Potentiate NMDA Receptor-Mediated Currents in R451C-NL3 Striatal Slices

如在不同脑区观察到的，在背侧纹状体中，离子型NMDA谷氨酸受体介导的内向电流/去极化通过同时激活代谢型mGlu5受体增强。因此，为进一步研究R451C-NL3纹状体中mGluI受体功能，我们分析了在SPNs全细胞膜片钳记录期间，浴应用DHPG诱导的NMDA受体介导电流的增强。NMDA（30 μM, 30 s, 6分钟间隔）的重复浴应用在WT和R451C-NL3小鼠的SPNs中诱导了幅度相似的瞬时内向电流。与50 μM DHPG孵育5分钟后，在WT SPNs中观察到NMDA介导的内向电流显著增强，但在R451C-NL3切片中未观察到。在进一步实验中，我们额外验证了mGlu5受体正变构调节剂（PAM）CDPPB是否能够增强突变小鼠SPNs中的NMDA受体介导反应。如图显示，类似DHPG，50 μM CDPPB在WT切片中增加了NMDA受体介导的内向电流，而未能在R451C-NL3小鼠的SPNs中增强NMDA诱导的电流反应。

这些数据显示mGlu5受体激活对NMDA介导反应的 positive调制被R451C-NL3突变破坏。为验证这种改变是否依赖于NMDA受体功能障碍，我们进一步分析了SPNs中离子型谷氨酸受体介导的突触后电流。我们的发现未显示WT和R451C-NL3切片间AMPA/NMDA比率的显著差异。AMPA和NMDA介导的电流动力学在两种基因型间也相似。

总体而言，这些数据表明R451C突变不影响AMPA或NMDA受体功能，因此提示mGlu5受体功能受损。

3.5 R451C-NL3 Mice Exhibit a Partial Postsynaptic Remodeling in the Dorsal Striatum

与积累的证据一致，表明在不同ASD实验模型的不同脑区中I组mGlu受体功能改变，我们的发现提示R451C-NL3小鼠背侧纹状体中mGluI受体信号受损。为调查这种损伤是否可归因于纹状体mGluI受体蛋白表达水平的改变，评估了WT和R451C-NL3小鼠背侧纹状体总裂解物中mGlu5和mGlu1受体的蛋白水平。我们观察到两种mGlu1和mGlu5受体亚型的轻微、不显著降低。I组mGlu5和mGlu1受体主要是突触后，PSD-95和SHANK3在组织和支架PSD信号分子中起关键作用，影响受体运输、锚定和表达。值得注意的是，我们观察到R451C-NL3小鼠背侧纹状体中PSD-95蛋白水平显著增加，而SHANK3蛋白水平显著降低。值得注意的是，背侧纹状体裂解物的Western blot分析显示NL3蛋白水平 considerable降低，与来自R451C-NL3小鼠模型不同脑区的先前报告一致，以及异源表达细胞系统。

此外，我们检查了AMPA和NMDA离子型谷氨酸受体亚基的蛋白水平。我们的分析表明两种基因型间NMDA受体亚基GluN2A和GluN2B的蛋白水平无显著差异。同样，在AMPA受体亚基GluA1和GluA2的水平中未观察到差异。

总体而言，我们的发现显示NL3基因中的R451C突变损害了纹状体谷氨酸能突触机器的结构和功能。相反，在皮质中未观察到mGlu5受体或PSD95蛋白水平的显著变化。

3.6 Altered Expression of mGluI-Associated Synaptic Proteins in the R451C-NL3 Striatum

I组mGlu受体主要位于突触后，在 perisynaptic区域，它们可以被持续突触传递期间释放的高水平谷氨酸招募，有助于长时程塑性变化。我们分析了它们在从R451C-NL3和WT小鼠背侧纹状体制备的突触体中的特异性表达。突触mGlu1受体水平在R451C-NL3和对照同窝小鼠间无统计学差异。相反，Western blot实验显示R451C-NL3纹状体突触体中mGlu5受体蛋白水平统计学显著降低。突触支架蛋白Homer是I组mGlu受体的已知结合伴侣，其表达在PSD重塑、