代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，原称非酒精性脂肪性肝病NAFLD）已成为全球最常见的慢性肝病，影响超过30%的成年人口。该疾病谱从单纯性脂肪变性到代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌（HCC）。MASLD的发病机制复杂，涉及代谢失调导致肝细胞内脂质过度积累，而有效的治疗策略仍然有限，迫切需要新的方法来缓解肝脏脂肪变性和阻止疾病进展。甜菜碱（N,N,N-三甲基甘氨酸）是一种天然存在的化合物，存在于甜菜、菠菜和海鲜等食物中，作为渗透调节剂在压力条件下调节细胞体积和维持组织完整性。临床研究表明甜菜碱具有肝保护作用，能显著减少非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的肝脏脂肪变性，且不良反应极少。然而，甜菜碱降脂作用的确切分子机制，特别是在饮食诱导的肝脏脂肪变性背景下，仍不清楚。微小RNA（miRNA）是一类长约20-22个核苷酸的非编码RNA，作为基因表达的关键调控因子，在MASLD等代谢性疾病中发挥重要作用。miRNA通过结合靶标mRNA，导致mRNA降解或翻译抑制，从而调控转录后基因表达。在肝脏中，miRNA是脂质稳态的核心调控者，调节脂肪酸合成、氧化和储存等关键代谢通路。特定miRNA的失调与MASLD的进展有关，使其成为调控脂质代谢的有吸引力的治疗靶点。胰岛素样生长因子-1受体（IGF1R）是一种受体酪激酶，整合胰岛素/IGF信号以调节肝细胞生长和代谢。在肝脏中，IGF1R可激活PI3K–AKT–mTOR和MAPK通路，影响SREBP-1c驱动的脂肪生成和脂肪酸处理；生长激素/IGF轴的扰动与MASLD严重程度相关。IGF1R也受到microRNA的转录后控制，miRNA介导的IGF1R抑制可减弱脂肪生成信号。本研究旨在探讨甜菜碱如何通过miRNA介导的机制缓解MASLD中的肝脏脂肪变性。研究人员假设口服甜菜碱通过恢复miR-96-5p表达以抑制IGF1R，从而减轻脂肪生成和甘油三酯积累，缓解饮食诱导的肝脏脂肪变性。为开展本研究，作者采用了以下主要关键技术方法：使用高脂饮食（HFD）喂养C57BL/6小鼠建立体内模型，并给予甜菜碱干预；利用油酸（OA）诱导HepG2细胞脂肪变性建立体外模型；通过小RNA高通量测序筛选差异表达的miRNA；采用实时定量PCR（RT-qPCR）和免疫印迹分别检测基因和蛋白表达水平；通过荧光素酶报告基因实验验证miR-96-5p与IGF1R的靶向关系；使用Oil Red O染色和甘油三酯测定评估脂质积累；通过siRNA敲低技术研究IGF1R的功能作用。3.1. 甜菜碱通过降低肝脏甘油三酯水平减轻HFD喂养小鼠的肝脏脂肪变性研究人员首先检测了甜菜碱对HFD诱导的肝脏脂肪变性的代谢影响。HFD喂养的小鼠体重显著增加，而甜菜碱补充显著降低了体重增加。肝脏组织的Oil Red O染色显示HFD组有大量脂质沉积，甜菜碱治疗组肝脏脂质积累显著减少。HFD喂养小鼠的甘油三酯（TG）水平显著升高，甜菜碱补充显著降低了TG水平，但高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）或空腹血糖浓度在各治疗组间无显著差异。3.2. 甜菜碱通过调节关键脂质代谢基因减少OA诱导的肝细胞脂质积累研究人员检测了甜菜碱对OA诱导的肝细胞脂质积累的影响。Oil Red O染色显示OA处理细胞脂滴积累显著增加，甜菜碱处理显著减少了OA处理细胞的脂质积累。TG定量证实OA+甜菜碱组的TG水平较OA组显著降低。OA处理显著上调了脂质处理相关基因的表达，包括乙酰辅酶A羧化酶1（ACACA）、肉碱棕榈酰转移酶-1A（CPT1A）和二酰基甘油酰基转移酶（DGAT），而甜菜碱共同处理使它们的表达恢复正常至接近对照水平。3.3. miR-96-5p介导OA诱导肝细胞的脂质减少为研究甜菜碱介导的microRNA调控在脂质代谢中的作用，研究人员分析了经甜菜碱处理和不处理的HFD喂养小鼠的miRNA表达。差异表达分析显示多个miRNA因HFD和甜菜碱处理而显著改变，其中miR-96-5p成为关键参与者。维恩图显示HFD和HFD+甜菜碱组间重叠的差异表达miRNA，热图进一步说明了包括miR-96-5p在内的不同处理组的 distinct miRNA表达模式。在OA处理的HepG2细胞中验证显示，OA处理显著降低了miR-96-5p表达，但甜菜碱共同处理恢复了其表达。功能实验表明，在OA处理的HepG2细胞中过表达miR-96-5p显著降低了脂质积累（通过Oil Red O染色显示）和TG水平。3.4. miR-96-5p靶向IGF1R调控脂质积累为研究miR-96-5p影响脂质积累的机制，研究人员使用多个miRNA数据库预测IGF1R为靶标。将IGF1R的野生型（wt）和突变型（mut）3'UTR克隆到荧光素酶报告载体中，并与miR-96-5p模拟物共转染。荧光素酶实验显示miR-96-5p显著降低IGF1R 3' UTR位点2的荧光素酶活性，而该位点的突变消除了此效应。Western blot分析进一步证明在OA诱导的HepG2细胞中过表达miR-96-5p显著降低了IGF1R蛋白表达。为评估功能影响，在OA诱导的HepG2细胞中使用siRNA敲低IGF1R，导致TG水平显著降低。最后，肝脏组织的免疫荧光染色显示HFD喂养小鼠IGF1R表达升高，但在HFD+甜菜碱组显著降低。研究结论表明，甜菜碱补充通过减少体重增加和肝脏脂质积累有效改善高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性。体外研究进一步显示甜菜碱抑制油酸诱导的HepG2细胞脂滴形成，并恢复脂质代谢相关基因。机制上，miR-96-5p成为这些保护效应的关键介质。甜菜碱显著增强miR-96-5p表达，导致甘油三酯积累减少和IGF1R的直接抑制。荧光素酶实验证实IGF1R是miR-96-5p的真实靶标，免疫荧光染色证实甜菜碱处理小鼠IGF1R水平降低。讨论部分强调，MASLD是由肝细胞中过度脂质积累驱动的全球主要健康挑战，与肥胖和胰岛素抵抗密切相关。尽管认识提高和发病机制理解进步，MASLD的有效治疗仍然有限。本研究突出了甜菜碱补充在缓解肝脏脂肪变性中的重要作用，主要通过调控miR-96-5p/IGF1R轴。研究结果提供了关键机制见解，说明甜菜碱作为一种天然存在的甲基供体，通过调节miR-96-5p表达和下调IGF1R介导其降脂效应，为MASLD提供了有前景的新治疗策略。临床意义上，研究发现突出了甜菜碱补充在解决肝脏脂质积累和脂肪变性方面的显著治疗潜力，这些都是MASLD进展的关键因素。作为一种安全且广泛可得的化合物，甜菜碱为管理MASLD提供了实用方法，特别是通过其减少肝脏脂质堆积的能力。通过恢复miR-96-5p水平和下调IGF1R，甜菜碱靶向了参与脂质代谢的关键调控轴，使其成为治疗和预防MASLD的有前景策略。此外，miR-96-5p有潜力作为追踪疾病进展或治疗反应的生物标志物，提供额外的临床效用。尽管基于miRNA的治疗仍处于起步阶段，但调节miR-96-5p为对抗代谢紊乱开辟了新途径，特别是那些以脂质失调为特征的疾病，并可能成为预防MASLD和相关肝病的有价值靶标。该研究发表在《Journal of Functional Foods》上，由Yuyao Xie、Ning Ding等来自中国医科大学附属第一医院消化内科的研究团队完成，得到了国家科技重大专项和非传染性慢性疾病项目等基金的资助。
