SMN缺失通过IGF1–Akt–OPG轴破坏成骨细胞-破骨细胞耦联导致脊髓性肌萎缩症骨代谢异常

本研究揭示了脊髓性肌萎缩症（SMA）中骨骼并发症的新机制。研究发现SMN蛋白缺失通过下调局部胰岛素样生长因子1（IGF1）表达，抑制PI3K-Akt信号通路磷酸化，减少成骨细胞分泌骨保护素（OPG），从而破坏成骨细胞-破骨细胞耦联，导致骨量减少。研究证实外源性OPG治疗可有效缓解骨代谢异常，为SMA骨骼并发症提供了潜在治疗靶点。

1 引言

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种致命的遗传性疾病，由存活运动神经元1（SMN1）基因缺失或突变引起。SMN蛋白水平降低导致脊髓α-运动神经元变性，引起进行性肌肉萎缩。虽然针对SMN蛋白水平的治疗方法显著延长了SMA患者的寿命并改善了神经发育结局，但大多数患者仍无法获得正常运动功能。骨骼健康是决定SMA患者运动功能和生活质量的关键因素之一。

已有研究报道SMA患者和小鼠模型中存在骨结构缺陷和骨折易感性增加。低骨矿物密度（BMD）在SMA患儿中极为普遍，38%的患者在年轻时经历过骨折。小鼠模型研究也观察到类似的骨缺陷，表明SMN在骨骼发育和骨重塑中可能发挥重要作用。然而，SMN是否以细胞自主方式影响骨代谢尚未明确。

本研究旨在探讨SMN在骨代谢中的作用，利用轻度SMA小鼠模型和髓系谱系及成熟破骨细胞中Smn1条件性基因敲除小鼠，评估骨结构并探索骨骼缺陷的分子机制。

2 材料与方法

2.1 动物实验

使用雄性小鼠以避免性别差异的混杂效应。轻度台湾小鼠模型（Smn1^−/−，SMN2^2TG/2TG）通过杂交产生。Smn1^flox/flox、Ctsk-Cre和Lyz2-Cre小鼠分别购自GemPharmatech和Cyagen Biosciences。通过杂交产生谱系特异性Smn1缺失小鼠，分别在3月龄时进行分析。

2.2 微计算机断层扫描分析

使用SkyScan 1174微CT系统评估骨微结构参数，包括骨矿物密度（BMD）、骨体积/组织体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）和骨小梁数量（Tb.N）。

2.3 组织学分析

骨组织经4%多聚甲醛固定，10% EDTA脱钙后石蜡包埋。5μm切片进行H&E染色、TRAP染色和免疫组织化学分析。使用OsteoMeasure软件进行骨组织参数定量。

2.4 细胞培养与分化

从股骨和胫骨分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）和骨髓源性巨噬细胞（BMMs），分别诱导分化为成骨细胞和破骨细胞。通过ALP染色、ARS染色、TRAP染色和F-actin细胞骨架染色评估分化能力。

2.5 分子生物学分析

采用Western blotting检测SMN、RUNX2、Sp7、NFATc1、CTSK、IGF1、OPG、RANKL等蛋白表达。通过qPCR分析基因表达水平。使用siRNA转染技术敲低Smn1基因表达。

2.6 统计学分析

数据以均值±标准差表示，使用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析。两组间比较采用双尾Student's t检验，多组比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 SMN缺陷导致骨量减少

3月龄SMA小鼠股骨远端H&E染色显示骨小梁显著减少。微CT分析表明BV/TV、Tb.N、Tb.Th和BMD显著降低，而Tb.Sp和皮质厚度无显著差异。腰椎（L1）μCT分析显示椎体骨小梁BV/TV和BMD显著降低，表明SMN缺失导致SMA小鼠早期骨量减少。

3.2 SMN缺陷抑制成骨细胞分化

Von Kossa染色显示SMA小鼠干骺端钙化显著减少。钙黄绿素双标记实验显示矿化沉积率（MAR）降低60%。虽然血清P1NP水平无显著变化，但SMA来源的BMSCs分化形成的成骨细胞矿化能力明显减弱。qPCR和Western blotting分析显示成骨细胞分化相关基因Runx2、Sp7和Bglap表达下调，RUNX2和Sp7蛋白水平显著降低。

3.3 SMN缺陷在体内增强骨吸收活性而在体外抑制破骨细胞分化

TRAP染色显示SMA小鼠骨小梁表面破骨细胞数量显著增加，血清CTX-I水平升高。然而，体外实验表明SMA来源的BMMs破骨细胞分化受到抑制，TRAP阳性多核破骨细胞数量减少，F-actin环结构变小，骨吸收面积显著减少。NFATc1和CTSK蛋白表达水平显著降低。

3.4 Ctsk-Cre或Lyz2-Cre小鼠中Smn1缺失对骨量无影响

在单核细胞和成熟破骨细胞中条件性敲除Smn1的小鼠模型显示，3月龄时骨小梁结构和骨量无显著变化。Smn1^ΔCtsk小鼠血清CTX1水平无变化，而Smn1^ΔLyz2小鼠显著降低。TRAP染色显示两种条件性敲除小鼠破骨细胞活性无显著差异，表明破骨细胞谱系中SMN条件性缺失不影响破骨细胞吸收活性或骨量。

3.5 SMN缺失抑制条件性基因敲除小鼠的破骨细胞分化

从Smn1^ΔCtsk和Smn1^ΔLyz2小鼠分离的BMMs破骨细胞分化能力显著受损。Western blotting分析显示破骨细胞分化过程中SMN表达逐渐增加，NFATc1和CTSK表达水平在两种条件性敲除小鼠中均显著降低，证实SMN对破骨细胞分化至关重要。

3.6 SMN缺陷下调成骨细胞中IGF1表达导致OPG表达减少

RNA测序分析显示SMN缺陷导致成骨细胞中254个基因上调和213个基因下调。KEGG通路分析显示破骨细胞分化通路富集。qPCR和Western blotting验证显示Tnfrsf11b（OPG）表达显著降低，而Tnfsf11（RANKL）轻微上调，导致RANKL/OPG比率显著增加。免疫组织化学染色显示SMA小鼠股骨远端OPG表达减少，RANKL表达无显著差异。

共培养实验表明，SMN敲低的成骨细胞支持破骨细胞形成的能力增强。机制上，SMN缺陷导致成骨细胞中局部IGF1表达下调，进而抑制PI3K-Akt信号通路，特别是磷酸化Akt（Thr308）减少，进一步下调OPG表达。肝脏中Igf1及相关因子表达无显著变化，但成骨细胞中IGF1蛋白水平显著降低。

3.7 OPG治疗缓解SMN缺陷诱导的成骨细胞和破骨细胞异常

在SMA成骨细胞-破骨细胞共培养体系中，OPG处理显著减少破骨细胞数量，增强成骨细胞矿化能力。ALP和ARS染色显示OPG治疗通过抑制破骨细胞活性和调节成骨细胞-破骨细胞耦联，间接促进成骨细胞功能。

4 讨论

本研究证实SMN是骨重塑的关键调节因子。首先，SMN缺陷抑制骨形成并激活骨吸收，导致SMA小鼠骨量显著减少。其次，SMN蛋白在破骨细胞分化过程中不可或缺，SMN敲低损害破骨细胞分化。髓系谱系和成熟破骨细胞中Smn1缺陷抑制破骨细胞分化，但不影响骨量。最重要的是，SMN缺失通过下调成骨细胞中局部IGF1表达，降低抗破骨细胞生成蛋白OPG水平，增加RANKL/OPG比率，破坏成骨细胞-破骨细胞耦联。

与野生型小鼠相比，本研究中使用的轻度SMA小鼠存活正常，但出生后几天出现尾部和耳廓坏死。研究发现4周龄轻度SMA小鼠尾椎数量、大小和骨质量减少，而在较晚时间点（3月龄）观察到类似的股骨骨量减少和骨小梁减少表型。这种差异可能源于本研究使用杂合子同窝仔作为对照而非WT小鼠。

骨量维持与骨形成和骨吸收之间的动态平衡密切相关。本研究发现轻度SMA小鼠破骨细胞形成/骨吸收增加，成骨细胞形成减少。尽管使用不同遗传背景小鼠，数据显示SMN蛋白在体外破骨细胞生成中不可或缺，来自轻度SMA小鼠和破骨细胞谱系条件性SMN缺失小鼠的BMMs中SMN缺失均抑制破骨细胞形成和活性。

考虑到体内外结果的矛盾，破骨细胞分化可能受到体内其他细胞的调节。重要的是，本研究发现SMN缺失显著抑制成骨细胞形成。近期研究表明，间充质干细胞（可分化为成骨细胞）中Smn1基因条件性敲除导致小鼠新生儿死亡，表明SMN蛋白在骨形成中起关键作用。一致地，本研究发现SMA小鼠BMSCs中OPG表达显著降低，表明SMN缺陷在成骨细胞谱系早期影响成骨细胞。

成骨细胞和破骨细胞可通过直接细胞-细胞接触、细胞因子或细胞-骨基质进行通信。成骨细胞通过RANKL/OPG、LGR4/RANKL/RANK、Ephrin2/ephB4和Fas/FasL等多种途径调节破骨细胞形成、分化或凋亡。OPG作为肿瘤坏死因子受体超家族成员，主要由成骨细胞产生。它作为RANKL的诱饵受体，阻止RANKL与其受体RANK相互作用，从而调节破骨细胞功能。因此，成骨细胞中RANKL/OPG比率是决定破骨细胞生成和骨吸收的关键因素。

研究发现OPG缺陷小鼠出现严重骨质疏松，而OPG敲入小鼠破骨细胞数量减少、骨量增加。Lewis等人证明内源性骨肽（PEPITEM）通过促进成骨细胞释放诱饵受体OPG，限制破骨细胞活性并增强骨小梁生长。本研究发现OPG水平显著降低，RANKL无显著变化，导致RANKL/OPG比率显著增加。OPG与RANKL结合减少促进破骨细胞分化和骨吸收活性。既往研究表明补充OPG可抑制骨吸收并增加骨量。与本研究发现一致，培养基中添加OPG可减弱共培养的SMN缺陷成骨细胞和破骨细胞中破骨细胞活性，表明OPG是SMN缺陷诱导骨丢失的关键因子。

OPG主要由成骨细胞分泌，受骨形态发生蛋白（BMPs）和胰岛素样生长因子1（IGF1）等多种细胞因子和激素调节。IGF1缺陷导致OPG显著减少，外源性IGF1给药可恢复骨中OPG水平。大部分IGF1由肝脏合成和分泌，在调节骨发育和骨稳态中起重要作用。Hua等人证明新生儿严重SMA小鼠肝脏中Igfals表达降低导致血清IGF1水平低。然而，本研究中未观察到轻度SMA小鼠肝脏中Igfals表达或IGF1蛋白水平变化。近期研究表明软骨细胞中SMN缺失降低局部IGF信号，影响生长板稳态和骨发育。一致地，本研究发现轻度SMA小鼠成骨细胞中IGF1蛋白水平显著降低，可能有助于OPG表达下调。IGF1减少与PI3K-Akt信号通路激活降低相关，磷酸化Akt（Thr308）水平显著降低。受损的PI3K-Akt信号进一步抑制OPG表达，破坏成骨细胞-破骨细胞耦联。因此，IGF1/PI3K-Akt/OPG轴失衡导致骨吸收增加，最终导致骨量减少。

本研究的一个潜在局限性是仅使用雄性小鼠以减少动情周期相关激素波动的混杂效应。虽然这种方法提高了内部一致性，但也限制了研究结果的普适性。由于男女患者均受SMA影响，未来研究应纳入两性以探索SMN相关骨病理的性别特异性机制。有必要建立成骨细胞相关条件性基因敲除小鼠以探索SMN在成骨细胞分化中的作用。但Hann等人构建的Prrx1^Cre；Smn1^f7/f7小鼠在出生后24小时内死亡。尽管如此，本研究数据强烈表明SMN缺失激活IGF1介导的成骨细胞OPG减少，抑制成骨细胞分化并促进破骨细胞分化，最终导致骨丢失。此外，SMN蛋白对破骨细胞分化至关重要，其缺失显著抑制破骨细胞活性。这些发现为针对SMA骨骼并发症的治疗干预提供了成骨细胞中的新靶点。