TREM2与apoE3相互作用在阿尔茨海默病中的分子结构解析及R47H与apoE4变异效应研究

本综述深入探讨了阿尔茨海默病（AD）两大关键遗传风险因子——髓系细胞触发受体2（TREM2）与载脂蛋白E（apoE）之间的直接相互作用。通过整合共识蛋白对接、分子动力学（MD）模拟与结合自由能分析，研究首次构建出实验一致的TREM2–apoE3复合物结构，揭示了新型相互作用界面，并阐明AD相关变异TREM2 R47H与apoE4通过改变结合模式与构象稳定性调控TREM2信号通路的分子机制，为靶向该相互作用的疗法开发提供了关键结构基础。

1 BACKGROUND

触发受体表达于髓系细胞2（TREM2）是一种在髓系谱系细胞（包括小胶质细胞）上表达的天然免疫受体，属于免疫球蛋白超家族成员，功能包括调节炎症信号、吞噬作用以及细胞增殖与存活。TREM2的遗传变异与多种神经退行性疾病相关，包括阿尔茨海默病（AD）。许多AD相关变异位于TREM2免疫球蛋白结构域，包括R47H变异——最强的AD遗传风险因素之一。TREM2的免疫球蛋白结构域包含三个结合位点：疏水位点、碱性位点和多聚化位点。疏水位点是位于三个互补决定区（CDR）样环顶端的疏水残基斑块；碱性位点是以R47、R62和R77为中心的碱性残基斑块，位于疏水位点边缘；多聚化位点主要由第二个β片层的残基构成，但疏水位点和碱性位点的部分残基也贡献于TREM2的多聚化。先前研究表明，神经退行性疾病相关变异对TREM2整体结构影响不大，但可能降低TREM2疏水位点的整体稳定性。

载脂蛋白E（APOE），特别是APOE ε4变异，是最普遍的AD遗传风险因素之一。在大脑中，apoE主要通过在各细胞间运输胆固醇和其他脂质来调节脂质稳态。apoE也沉积于AD的淀粉样斑块中。apoE具有多个已描述的结合位点，包括位于N端结构域第四螺旋的低密度脂蛋白受体（LDLR）结合位点、C端结构域中的脂质结合位点，以及铰链区中的TREM2结合位点。TREM2–apoE结合在小胶质细胞对淀粉样斑块的反应中扮演重要角色。尽管有论文表明apoE需要脂化才能与TREM2结合，但当前多数文献支持TREM2与apoE的结合不受其脂化状态影响。

诱变研究已鉴定出多个对TREM2–apoE结合至关重要的TREM2残基。将TREM2疏水位点中的疏水侧链替换为带负电荷侧链的突变（如L69D）会极大减少TREM2–apoE结合。同样，降低TREM2疏水位点稳定性的突变（如T66M和Y38C）也会损害TREM2结合脂化apoE的能力。这些研究表明apoE与TREM2疏水位点中的残基相互作用。此外，apoE中截断C端结构域（残基239–299）以及同时截断C端结构域和铰链区（残基192–299）的截断突变分别导致TREM2–apoE结合轻微下降和近乎完全丧失，这表明apoE中192至238残基可能是TREM2的潜在结合位点。

2 METHODS

2.1 Consensus protein–protein docking and TREM2–apoE3 complex structure selection

本研究使用共识蛋白-蛋白对接方法，结合四种成熟的蛋白-蛋白对接程序（ClusPro、HADDOCK、ZDOCK和LZerD）来构建实验一致的TREM2–apoE3复合物结构。用于对接的TREM2结构来自高分辨率六聚体TREM2 X射线结构（PDBID: 5UD7）的单体亚基。为消除多聚化对对接前单体亚基的影响，使用分子动力学（MD）模拟对TREM2结构进行平衡，并从模拟中获得平衡后的代表结构。用于对接的apoE3结构是单体、具有生物活性、全长人apoE3样变体的核磁共振（NMR）结构（PDBID: 2L7B），该结构在apoE C端含有五个突变以防止apoE形成寡聚体。对接前，使用Amber18 MD模拟程序对apoE3结构进行能量最小化。

为生成潜在的TREM2–apoE3复合物结构，首先使用蛋白-蛋白对接程序，以实验确定的TREM2与apoE结合位点为约束，将平衡后的TREM2结构与最小化的apoE3结构进行对接。使用了六种蛋白-蛋白对接方法来减少单一方法的偏差。对于基于吸引力的对接程序，TREM2上的约束区域包括残基35至51、64至79、83至96以及110至121；apoE3上的约束区域是残基181至248。对于基于排斥的对接程序，则为TREM2和apoE选择了相反的残基。随后进行了无约束的第二轮对接以确定程序能否在没有约束的情况下识别相似的复合物。

每种对接方法预测的TREM2–apoE3复合物结构都进行了聚类。从每种方法的前四个簇中选取代表最佳潜在复合物的结构。将这些结构重新聚类，并选取簇中心最接近的代表性复合物进行进一步的MD模拟和结合自由能分析。最终，将MD模拟结果与实验数据进行比较，以确定一个实验一致的TREM2–apoE3复合物结构。

2.2 TREM2-apoE3 complex structure systems for MD simulations

对于MD模拟中已识别簇的代表性TREM2–apoE3复合物结构，为了比较TREM2中关键残基突变、apoE3中的截断突变以及apoE4变异对我们构建的TREM2–apoE3复合物结构的影响，使用PyMOL的诱变插件工具获取了每个前五预测复合物结构的TREM2 R47H–apoE3和TREM2 L69D–apoE3复合物结构。基于顶级TREM2–apoE3复合物结构，还获得了TREM2–apoE4、TREM2–截断apoE3（残基239至299）以及TREM2–截断apoE3（残基192至299）的复合物结构。

2.3 MD simulations

预测的TREM2–apoE复合物结构使用AMBER 18 MD模拟包和ff14SB力场进行能量最小化和模拟。每个模拟至少运行500 ns以确保系统充分平衡，并至少有300 ns的平衡轨迹用于进一步分析。每个MD模拟在周期性盒子中进行，蛋白质外层与盒子边界之间有2 nm的溶剂以减少周期性伪影。盒子中填充TIP3P水，并添加浓度为0.15 M的Na⁺和Cl⁻离子以模拟生理条件。添加额外离子以中和TREM2–apoE复合物结构的电荷。设置好溶剂化蛋白质系统后，首先在约束TREM2–apoE复合物结构和离子的情况下对水溶剂进行最陡下降最小化。接着，在恒定粒子数-压力-温度（NPT）下，于50 K和1 bar下平衡最小化的水分子（约束复合物和离子）20 ps。为将系统加热至300 K，运行了一系列50、100、150、200、250和300 K下恒定粒子数-体积-温度（NVT）的10 ps MD模拟。加热后，为每个模型设置MD生产模拟，运行500 ns，在300 K和1 bar的恒定NPT下进行。静电相互作用通过粒子网格Ewald方法计算，Lennard-Jones截断设置为1.0 nm。所有MD模拟对所有氢-重原子键使用SHAKE约束，允许2 fs的时间步长。

2.4 Binding free energy analysis

为理解TREM2关键残基突变、apoE3截断突变和apoE4对TREM2与apoE之间相互作用的影响，如先前所述计算了TREM2–apoE复合物结构的结合自由能。受体-配体复合物的结合自由能通过计算结合焓与结合熵的差值来确定。结合焓使用AMBER18中的分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MMPBSA）方法计算，使用平衡轨迹中每150 ps间隔的快照。由于计算成本高，结合熵计算使用正常模式分析，间隔为1.5 ns。使用bootstrap统计方法计算平衡轨迹部分各结合自由能组分的平均值和标准偏差。根据结合自由能近似解离常数K_d。

2.5 Equilibration analysis

对于TREM2–apoE复合物结构，为确定模拟系统的平衡和收敛，使用了MD模拟的逐帧焓快照。对于顶级选定的TREM2–apoE复合物结构，除焓外，还计算了随时间变化的熵以帮助确定系统平衡时间。对于未结合的TREM2或apoE3系统，计算了单个TREM2或apoE3分子主链α碳原子随时间的均方根偏差（RMSD）以确定模拟系统的平衡和收敛。基于这些分析，确定了每个模拟达到系统平衡所需的模拟时间，并使用每个轨迹平衡点后的300 ns进行结合亲和力、残基间相互作用、结构、构象和动力学的进一步分析。

2.6 Energy decomposition analysis

为识别参与TREM2和apoE结合的关键残基，使用了能量分解分析。能量分解分析是一种将焓项（不含非极性溶剂化能）分解为其个体组分的方法，以确定哪些残基对TREM2和apoE的结合贡献最大。使用AMBER18对每个TREM2–apoE复合物结构进行能量分解，以确定哪些残基对结合焓的总贡献最强。

2.7 Hydrogen bond analysis

额外计算了氢键形成以识别TREM2和apoE3之间的任何氢键和盐桥形成。当供体重原子和受体之间的距离小于3 Å且角度不小于135°时，分配一个氢键。为计算两个残基之间氢键的占据百分比，计算了平衡轨迹中存在至少一个氢键的轨迹百分比。

2.8 MD simulation trajectory clustering analysis

对于最实验一致的TREM2–apoE复合物结构的每次模拟，对最后300 ns的平衡轨迹进行聚类分析以确定模拟的代表性结构。使用基于密度的噪声应用空间聚类（DBSCAN）算法执行聚类分析。为确定DBSCAN聚类算法的参数并最小化每次模拟的偏差，生成了K分布图（K=5）以确定每次模拟的epsilon（簇间最小距离的截断值）。运行后，DBSCAN聚类算法为每个簇生成一个代表性结构，用于进一步分析。

2.9 Conformational stability

为确定蛋白质主链灵活性的变化以评估构象稳定性，计算了最实验一致的TREM2–apoE复合物结构模拟以及单独TREM2和apoE3模拟的最后300 ns平衡轨迹中每个氨基酸每个α碳的均方根波动（RMSF）。

2.10 Secondary structure

为确定TREM2和apoE3的相互作用如何随时间改变其二级结构，确定了每个残基在平衡轨迹帧中作为α-螺旋、3₁₀-螺旋、β-片层或非结构化的占据百分比。使用AMBER的cpptraj模块中的定义蛋白质二级结构（DSSP）方法为每帧的每个残基分配二级结构，基于TREM2–apoE3复合物结构最后300 ns平衡MD模拟轨迹。计算每种二级结构类型在300 ns MD模拟轨迹上的占据百分比，以确定TREM2–apoE3相互作用如何改变这些二级结构的占据。

2.11 Inter-/intra-residue distances

使用残基间/残基内距离来识别由相互作用或AD相关TREM2 R47H和apoE4变异引起的结合位点位置或TREM2–apoE复合物结构重排的变化。为计算残基间/残基内距离，测量了TREM2–apoE复合物结构最后300 ns平衡MD模拟轨迹中每个复合物每个残基的α碳之间的 pairwise 距离。为每个复合物生成一个N × N的均方根平均值矩阵。

2.12 Free energy landscapes and principal component analysis

使用主成分分析（PCA） followed by 生成自由能景观（FEL）图，研究了未结合TREM2和apoE3的不同构象，是什么运动驱动了这些变化，以及当TREM2与apoE3相互作用时这些运动和构象如何改变。如先前所述进行PCA分析和FEL图生成。PCA分析前，将TREM2野生型（WT）–apoE3复合物结构模拟按其两种蛋白质分离，得到WT TREM2的轨迹和apoE3的第二条轨迹。对于每条轨迹，首先取模拟的平衡部分并将帧对齐以去除模拟中存在的平移和旋转运动。以α碳原子为目标，使用Amber工具cpptraj程序实施PCA分析。生成一个3N X 3N位置协方差矩阵，然后对其进行对角化以生成特征向量和特征值。特征向量描述运动方向，而特征值描述运动幅度。第一PCA模式描述了系统在MD模拟平衡部分期间最大的构象波动方向和幅度，每个后续PCA模式描述下一个最大的波动。为生成FEL图，使用GROMACS sham模块，使用前两个PCA模式的投影。FEL图中的每个自由能值G_i根据先前描述计算。

2.13 Electrostatic potential

生成静电势图以分析静电势对结合的贡献，以及分析TREM2和apoE的相互作用如何影响静电表面电势，使用自适应泊松-玻尔兹曼求解器（APBS）。从平衡轨迹聚类最大簇中选择代表性结构作为每个模拟的模型。使用PDB2PQR软件包为模型中的每个原子生成AMBER半径和电荷。PQR文件用作输入以为每个模型生成静电表面电势的连续图谱。

2.14 Analysis of apoE conformational heterogeneity

为确定apoE构象异质性对我们最实验一致模型的潜在作用，检查了来自先前研究中马尔可夫状态模型的8000个apoE4结构（总聚合时间为3.45 ms）。首先分析了三个残基对的α碳之间的距离：223至291（以确保结果与先前分析一致）、153至274以及99至255，以观察C端与N端分离的频率。此外，使用MMTSB cluster.pl对马尔可夫状态模型中的8000个结构进行聚类，并将簇的质心与最实验一致的模型对齐，确定了有多少结构（无论构象状态如何）可能形成碱性位点和C端尾部之间的相互作用。

2.15 Statistical analysis

为比较结合能的差异，计算了不同结合自由能组分的平均值和标准偏差。由于MD轨迹中的相邻帧往往彼此高度相关，通过自举统计独立区间的平均值来计算不同结合自由能组分的平均值和标准偏差，如先前所述。结合自由能的平均值比较使用单因素方差分析（ANOVA），然后使用Tukey–Kramer honestly significant difference（HSD）事后检验将每种TREM2–apoE复合物结构变体与TREM2 WT–apoE3复合物结构进行比较。

3 RESULTS

3.1 Construction of potential TREM2–apoE3 complex structures via consensus protein–protein docking

为构建潜在的TREM2–apoE3复合物结构，使用六种对接方法（带吸引力约束的ClusPro、带排斥约束的ClusPro、HADDOCK、带RDOCK的ZDOCK 2.3.2、带ZRANK的ZDOCK 3.0.2和LZerD）进行了共识蛋白-蛋白对接，约束基于实验数据，然后对每种方法中的复合物进行聚类。基于簇大小和结合亲和力，从每种方法中选择前四个复合物，总共24个复合物。将这24个复合物重新聚类，识别出五个簇。

在识别出的前五个簇中，apoE3直接结合到TREM2的所有三个CDR环上，簇一、二、四和五之间存在轻微的旋转差异。此外，TREM2疏水位点与apoE3铰链区已识别的TREM2结合位点的前11个和最后6个残基（残基192–201和233–238）以及apoE3的N端结构域（螺旋3）相互作用。对于簇三中的结构，apoE3仅与TREM2上的CDR2和CDR3相互作用，并且TREM2仅预测与apoE3铰链区的单个片段（残基189–199）相互作用。总之，这些预测的TREM2和apoE3之间的相互作用区域与生物层干涉（BLI）结合研究一致。

为确定实验约束对不同蛋白-蛋白对接程序的影响，再次将TREM2与apoE3对接，但无约束。这产生了许多不同的TREM2–apoE3复合物，其中一些不与疏水位点或铰链区相互作用，但除HADDOCK外，所有对接程序都有一个结构与实验引导对接中的簇一、四和五相似。此外，无偏对接中的一些其他结构与实验引导对接中未聚类的结构相似，表明无偏对接识别了相似的结合姿势。因此，用于与先前实验数据保持一致的约束似乎优化了无偏对接中识别的姿势。

3.2 Evaluation of top five predicted TREM2–apoE3 complex structures with MD simulations, binding free energy analyses, and validation with experimental BLI binding data

为确定五个选定的TREM2–apoE3复合物结构中哪一个与实验数据最一致，使用MD模拟和结合自由能分析比较了apoE3与WT TREM2 versus R47H和L69D TREM2变体的结合，这些变体显示会减少TREM2–apoE相互作用。使用PyMOL的诱变插件工具将R47H和L69D变异引入每个前五个TREM2–apoE3复合物结构中。对apoE3与WT TREM2、TREM2 R47H变体或TREM2 L69D变体分别进行MD模拟，并为每个复合物结构的每个模拟系统分离出至少300 ns的平衡轨迹。基于每个模拟系统轨迹的平衡部分，计算了TREM2和apoE3之间的平均结合焓。与BLI结合数据冲突的是，L69D变体极大地增加了模型2和4的TREM2–apoE3结合亲和力，而R47H极大地增加了模型1和3的TREM2–apoE3结合。只有模型5显示出与BLI一致的模式，R47H变体导致相当稳定的TREM2–apoE3结合焓，而L69D极大地降低了亲和力。模型5的额外分析也显示了apoE3和apoE4之间相似的结合焓，并重现了我们先前使用apoE3截断的BLI发现，显示截断apoE3 after残基239适度降低了TREM2–apoE3结合，截断 after残基192导致更大的结合损失。因此，模型5被初步选为前5个预测TREM2–apoE3复合物结构中的最佳模型。

虽然焓分析 alone 可以揭示由变异引起的结合亲和力的大趋势，但小的变化，例如模型5中TREM2 R47H或apoE4变体引起的结合亲和力轻微增加，可以通过包含熵组分在内的完整结合自由能计算来更精确地分析。因此，我们加入了使用正常模式分析估算的结合熵，以确定模型5 TREM2–apoE3复合物结构与三种TREM2变体（WT、R47H和L69D）和三种apoE变体（apoE4、apoE3 239–299截断和apoE3 192–299截断）的结合自由能。我们的结合自由能结果表明，TREM2 R47H变体降低了TREM2–apoE3结合，而TREM2 L69D变体几乎废除了TREM2-apoE3结合，同时apoE4轻微增加了TREM2–apoE结合。此外，两种apoE截断突变降低了TREM2–apoE3结合自由能，apoE3残基192至299截断比apoE3残基239至299截断具有更强的结合损失。TREM2 R47H变体将结合自由能降低了1.12 kcal/mol，apoE4将结合自由能增加了0.71 kcal/mol compared to WT TREM2。这分别代表了6.54倍更弱的解离常数和3.29倍更强的解离常数，将我们的结果置于与先前BLI实验结果的相似量级，先前结果显示R47H具有2.3倍更弱的解离常数，apoE4具有1.57倍更强的解离常数。我们对其他突变的结果表明，每个额外测试的变体的解离常数都有非常大的下降。这些观察结果与BLI实验数据一致，进一步支持模型5作为实验一致的TREM2–apoE3复合物结构。

3.3 TREM2's basic and hydrophobic sites are involved in TREM2–apoE3 binding in experimentally consistent model

随着模型5被确定为实验一致的复合物结构，我们接下来探究了哪些残基和何种类型的结合驱动了TREM2–apoE相互作用。来自平衡的TREM2 WT–apoE3模拟的代表性结构显示，TREM2的三个CDR环（构成疏水位点的基础）与apoE3的铰链区和apoE3 N端结构域的一部分相互作用。此外，TREM2碱性位点的一部分与apoE3的C端尾部相互作用。对TREM2和apoE3中哪些残基对结合焓贡献最大的能量分解分析表明，几个TREM2的相互作用残基与先前的实验研究一致，包括AD相关的碱性位点残基R47和R62，以及疏水位点的多个残基，如L69和W70。除了先前BLI研究中鉴定的残基外，TREM2残基L89（CDR3上的一个疏水残基）也对结合有强贡献。

在apoE3中，我们发现结合是由N端螺旋3中107至126范围内的几个残基和铰链区中193至202的残基驱动的，另外还有残基52和C端尾部中296至299残基的贡献。不出所料，当将每个残基的焓贡献分解为范德华力、静电力和极性溶剂化能时，我们发现TREM2中大多数高亲和力相互作用是由疏水位点的范德华力相互作用驱动的，碱性位点有少量额外的静电力相互作用。值得注意的是，对结合焓贡献超过± 0.5 kcal/mol的仅有的两个TREM2多聚化位点残基（D86和D87）具有正的总结合焓，削弱了TREM2–apoE3相互作用。在apoE3中，与TREM2疏水位点相互作用的N端螺旋3和铰链区残基主要由范德华力相互作用驱动，而与TREM2碱性位点相互作用的残基（apoE3 C端尾部）则由静电力相互作用驱动。

对于静电表面电势分析，我们分析了TREM2和apoE3的相互作用表面。第一个相互作用表面介于TREM2的CDR环与apoE3的N端螺旋和铰链区之间。相比之下，TREM2的碱性位点保持了其正电表面，并直接与apoE3带负电的C端尾部相互作用。氢键分析证实了TREM2碱性位点残基（R47、R62、H67、N68和R77）与apoE3 C端尾部（D297–H299）之间存在多个瞬时氢键，其中TREM2的R47与apoE3的H299末端羧酸盐之间的盐桥几乎存在于整个平衡模拟过程中。还注意到TREM2的CDR环与apoE3 N端之间存在额外的氢键，特别是在焓分解中显示出相对较强静电组分的残基中，例如TREM2 W70与apoE Q117。总之，对模型5的TREM2–apoE界面的分析与先前的生物物理数据一致，显示TREM2的CDR环与apoE3的铰链区和N端螺旋3相互作用，而TREM2的碱性位点，特别是AD相关的R47残基，主要与apoE的C端尾部相互作用。

虽然我们使用的模型是单体apoE3结构（PDBID: 2L7B）带有防止多聚化的人工突变，但我们预计这些突变不会对结合姿势产生强烈影响，因为这些突变中没有哪一个对TREM2–apoE3相互作用有强/任何贡献。先前研究表明，apoE3 C端的五个突变（F257A/W264R/V269A/L279Q/V287E）阻止多聚化，对apoE的结构或稳定性没有影响，并且突变体apoE3具有相似的脂质结合活性和相同的LDLR结合活性。此外，先前一项比较突变单体apoE3与WT单体apoE3（均未脂化并在长尺度MD模拟[1.5 µs]中脂化）的计算研究发现，WT单体apoE3的构象与突变单体apoE3的构象非常相似。为验证这些突变不会极大地改变我们预测的TREM2–apoE结合姿势，我们取模型5的平衡TREM2–apoE3结构，将apoE3人工突变回复为WT，运行MD模拟，并分析最后300 ns的平衡轨迹。具有人工突变的apoE3结构与WT apoE3结构之间的整体TREM2–apoE3结合姿势保持非常相似。具有焓分解的额外分析进一步验证了这些结果，显示WT apoE3的关键TREM2残基与突变apoE3结构几乎相同，有三个主要差异：R62、S65和R77（TREM2碱性位点中的三个残基）显示出对结合的贡献增加。类似地，apoE3焓分解再次显示WT和突变apoE3结构之间的分布相似，并且五个人工突变在TREM2–apoE3相互作用中不扮演直接角色。最后，我们检查了具有突变体和WT apoE3的TREM2–apoE3残基间距离图，发现几乎没有差异，表明人工突变在TREM2–apoE3相互作用中不扮演重要角色。

此外，对于我们的模型，我们使用了处于闭合构型的apoE；然而，先前研究表明apoE具有构象异质性，其中一项研究广泛显示了C端的变化性。虽然我们模型中TREM2–apoE3之间的主要相互作用是TREM2疏水位点与apoE3 N端/铰链相互