LncRNA NRIR通过RSAD2/NF-κB轴促进巨噬细胞M1极化抑制种植体周围炎骨生成

本研究揭示了长链非编码RNA NRIR在种植体周围炎中的新机制：通过上调RSAD2激活NF-κB信号通路，促进巨噬细胞M1极化，进而抑制骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化。该发现为种植体周围炎的发病机制提供了新见解，并为未来治疗策略开发提供了潜在靶点。

引言

种植体周围炎是一种影响骨结合种植体周围硬组织和软组织的炎症性疾病，以进行性牙槽骨破坏为特征。长链非编码RNA负调控干扰素反应（lncRNA NRIR）被广泛认为是某些自身免疫性疾病的生物标志物并参与其发病机制。先前研究发现NRIR在种植体周围炎组织中显著上调，提示其潜在作用。种植体周围炎病变中常存在大量M1巨噬细胞浸润，因此本研究探讨了NRIR在种植体周围炎巨噬细胞极化中的调控作用及潜在机制。

材料与方法

通过转录组测序分析发现，含自由基S-腺苷甲硫氨酸结构域蛋白2（RSAD2）是巨噬细胞中与NRIR相互作用的mRNA。采用siRNA基因敲低技术，抑制了THP-1细胞来源的M1巨噬细胞中NRIR和RSAD2的表达。随后，利用RT-qPCR、蛋白质印迹、流式细胞术和免疫荧光染色评估炎症细胞因子和M1巨噬细胞相关标志物的水平，旨在阐明NRIR/RSAD2/NF-κB轴在巨噬细胞极化中的作用。收集NRIR敲低巨噬细胞的上清液用于制备骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养液。通过RT-qPCR、蛋白质印迹、碱性磷酸酶（ALP）活性和茜素红S（ARS）染色评估BMSCs中成骨相关因子的表达。此外，建立大鼠种植体周围炎模型，在使用不同巨噬细胞上清液处理后，通过微型CT扫描和免疫组织化学评估种植体周围组织炎症程度和骨丢失情况。

结果

NRIR敲低降低了RSAD2表达并抑制了NF-κB通路的激活，从而减少了THP-1巨噬细胞中炎症细胞因子和M1巨噬细胞相关细胞因子的表达。在功能上，巨噬细胞中NRIR敲低促进了BMSCs的成骨分化。体内实验表明，来自NRIR敲低巨噬细胞的上清液导致炎症浸润减少、骨吸收减弱以及成骨相关因子表达增加。

讨论

本研究证明NRIR通过RSAD2/NF-κB轴激活M1巨噬细胞，在种植体周围炎中发挥促炎调节剂的作用，为种植体周围炎的发病机制提供了新的见解，可能为未来的预防和治疗策略提供信息。

1 引言

种植体周围炎是由种植体周围组织细菌生物膜积累引起的严重生物并发症，导致种植体周围黏膜炎症和随后的进行性骨丢失。过去30年间，种植体周围炎已成为牙科领域的重要临床问题。骨免疫学研究表明，单核/巨噬/破骨细胞谱系与间充质干细胞-成骨细胞谱系之间的持续串扰决定了是建立持久的假体-种植体界面还是发生种植体松动。因此，探索巨噬细胞和间充质干细胞之间的相互作用可以阐明种植体周围炎的发病机制。

巨噬细胞响应环境刺激而发生极化，M1巨噬细胞 critically 参与细菌诱导的炎症发展，而M2巨噬细胞有助于炎症消退和组织修复。在慢性溶骨性疾病（如关节炎和牙周炎）的骨破坏部位，有大量M1巨噬细胞积聚。这些巨噬细胞产生大量促炎细胞因子（TNF-α、IL-1、IL-12、IFN-γ）、趋化因子和基质金属蛋白酶，诱导破骨细胞生成、组织侵蚀和进行性骨破坏。研究表明，M1巨噬细胞表达增加与更深的牙周探诊深度显著相关。值得注意的是，种植体周围炎病变样本显示出M1巨噬细胞群显著增加。这种现象可能在晚期种植体周围炎阶段特征性的破坏性炎症反应和严重种植体周围骨溶解中起重要作用。

近年来，长链非编码RNA（lncRNAs）因其在细胞、分子和病理生理过程中的丰度和潜在调控作用而引起了相当大的科学兴趣。LncRNAs与DNA、RNA或蛋白质相互作用，从而调控转录、转录后和翻译结果。关于lncRNA功能的研究表明，它们在炎症性疾病（包括种植体周围炎和牙周炎）中具有作为诊断/预后生物标志物和治疗靶点的潜力。LncRNA负调控干扰素反应（NRIR）是一种干扰素刺激基因，被广泛认为在自身免疫性皮肤病（如系统性硬化症和系统性红斑狼疮）的发病机制中起重要作用。然而，关于NRIR、巨噬细胞极化和种植体周围炎之间关系的研究报道很少。进一步阐明这些潜在机制将增强我们对种植体周围炎发病机制的理解，并有助于预防和治疗方法的开发。

先前研究表明，NRIR在种植体周围炎软组织中显著上调。本研究进一步探讨了NRIR在与种植体周围炎相关的巨噬细胞极化中的作用。通过RNA测序，我们初步确定RSAD2为NRIR的潜在靶点。随后的体外实验表明，NRIR调控RSAD2表达，进而影响NF-κB激活和M1巨噬细胞极化。此外，来自NRIR敲低巨噬细胞的上清液上调了骨髓间充质干细胞（BMSCs）中成骨因子的表达，并减轻了大鼠种植体周围炎模型的炎症和骨丢失。总之，本研究为种植体周围炎的发病机制提供了新的见解，并可能为未来的预防和治疗策略提供信息。

2 材料与方法

2.1 细胞培养与刺激

THP-1人单核细胞系购自Biospecies（中国广东）。THP-1细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640）培养基中培养。为诱导分化为M1巨噬细胞，THP-1细胞用200 ng/ml佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）刺激24小时以形成贴壁的M0巨噬细胞，然后用100 ng/ml LPS和20 ng/ml IFN-γ处理48小时。

人间充质干细胞购自Oricell（中国广州），并在补充有10% FBS和1%青霉素-链霉素的最低必需培养基α（α-MEM）中培养。

所有细胞培养均在37°C、5% CO₂条件下的Esco CelMate二氧化碳（CO₂）培养箱中维持以模拟生理环境。

2.2 细胞转染

特异性靶向NRIR和RSAD2的小干扰RNA（siRNAs）购自OBIO（中国上海），非靶向siRNA用作阴性对照（NC）。siRNA和NC序列见补充表S1。含有全长RSAD2的过表达质粒和对照质粒也从OBIO（中国上海）获得；质粒详情见补充图S1。

对于siRNA转染，将5 × 10⁵个THP-1细胞接种到六孔板中培养24小时，然后在Opti-MEMI Reduced Serum Medium中再培养12小时。随后，使用7.0 μl CALNPTM RNAi试剂A和2.0 μl CALNPTM RNAi试剂B将100 pmol siRNA转染到每个孔中。

对于质粒转染，将5 × 10⁵个THP-1细胞接种到六孔板中培养24小时。当达到约80%汇合度时，每孔用4.8 μl Lipofect5000试剂和200 μl Trans buffer转染3 μg质粒DNA。

2.3 RNA测序

使用TRIzol试剂从M1巨噬细胞中提取总RNA。RNA质量评估、文库制备、测序、质量控制、将读数映射到参考基因组以及差异基因表达分析由诺禾致源有限公司（中国北京）进行。对于功能注释，进行了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，以阐明与差异表达基因（DEGs）相关的基因功能和相关通路。进一步进行基因集富集分析（GSEA）以识别关键的KEGG信号通路。使用R软件（版本4.40）通过主成分分析（PCA）、火山图、热图和通路富集图可视化数据。RNA-seq数据已存入NCBI序列读段存档（SRA）（BioProject ID: PRJNA1281584；BioSample accession numbers: SAMN49569226, SAMN49569227, SAMN49569228, SAMN49569229, SAMN49569230, and SAMN49569231）。

2.4 实时定量聚合酶链反应

使用SteadyPure Rapid RNA Extraction Kit从THP-1巨噬细胞和BMSCs中提取总RNA。使用Evo M-MLV RT Mix Kit将RNA反转录为互补DNA（cDNA）。随后，使用SYBR^® Green Premix Pro Taq HS RT-qPCR Kit进行RT-qPCR。使用2^-ΔΔCt方法计算相对基因表达水平。由Sangon Biotech（中国上海）合成的引物列于补充表S2。

2.5 蛋白质印迹法

使用总蛋白提取试剂盒从THP-1细胞和BMSCs中提取总蛋白。使用BCA测定试剂盒定量蛋白质浓度。离心后（12,000 × g，4°C，10分钟），蛋白质裂解物通过10%或12.5% SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜在含有Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）中用5%脱脂牛奶在室温下封闭2小时，然后在4°C下与以下一抗孵育过夜：RSAD2、CD86、iNOS、phospho-p65、p65、phospho-IκB、IκB、骨桥蛋白（OPN）、骨钙素（OCN）、runt相关转录因子2（RUNX2）和GAPDH。随后，将膜在TBST中洗涤三次（每次10分钟），并在室温下与HRP偶联的二抗孵育2小时。使用增强化学发光试剂和iBright CL1000成像系统可视化蛋白质条带。使用ImageJ软件（v1.8.0）进行蛋白质表达的半定量分析。

2.6 流式细胞术

巨噬细胞成功极化后，收获THP-1细胞并过滤以制备单细胞悬液。使用人Fc受体封闭溶液阻断Fc受体介导的非特异性结合。将细胞洗涤三次，在冰上用PE偶联的抗CD86抗体在含有1% FBS的染色缓冲液中染色，并使用FACSMelody流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件进行数据分析。

2.7 免疫荧光染色

THP-1细胞用4%多聚甲醛（PFA）固定30分钟，在室温（20°C）下用0.5% Triton X-100透化30分钟，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用5%山羊血清封闭1.5小时（37°C）。随后，细胞在4°C下与抗CD86和iNOS的一抗孵育过夜。用PBS洗涤三次后，细胞与荧光二抗在37°C下避光孵育1小时。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染细胞核。使用激光扫描共聚焦显微镜观察染色细胞。

2.8 巨噬细胞上清液制备

将M0巨噬细胞转染，随后用LPS/IFN-γ极化48小时成为M1巨噬细胞。然后将细胞用PBS洗涤三次，并在无血清培养基中再培养24小时。收集上清液（SNs），离心（300 × g，10分钟）去除细胞碎片，并过滤（0.22 μm过滤器）。一部分SNs与成骨诱导培养基按1:1混合用于BMSCs共培养实验，其余部分直接用于体内实验。

2.9 碱性磷酸酶活性和茜素红S染色

BMSCs在达到80%汇合度时进行成骨诱导。14天后，使用ALP染色试剂盒评估ALP活性。21天后通过茜素红S（ARS）染色评估钙矿化。使用立体显微镜观察显色反应。

2.10 体内实验

30只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（8周龄）购自西南医科大学动物中心。所有手术程序均经西南医科大学动物伦理委员会批准（SWMU20210414），并遵循ARRIVE指南。

详细手术程序如先前研究所述。简言之，在通过吸入4%异氟烷诱导的全身麻醉下拔除SD大鼠的单侧上颌第一磨牙。愈合4周后，同样麻醉大鼠，并在手术部位施用局部麻醉（含1:100,000肾上腺素的阿替卡因）。在上颌第一磨牙区域做牙龈切口，并使用铰刀（直径1.6 mm）准备种植体窝。然后插入定制的Ti-6AL-4V螺钉型种植体（直径2mm，螺纹长度3mm，光滑颈1.5mm）。允许4周时间进行骨结合。4周后，因死亡（n = 3）或种植体松动（n = 4）排除了7只大鼠。剩余大鼠使用随机数字表随机分配到四组：（a）对照组（n = 5）；（b）LPS组（n = 6）；（c）si-NC-SN组（n = 6）；和（d）si-NRIR-SN组（n = 6）。

对每组应用不同的处理。在LPS组中，每三天一次向种植体周围的牙龈沟注射来自牙龈卟啉单胞菌的LPS（1 mg/mL，每次注射10 µL），持续两周，以建立种植体周围炎。在对照组中，用PBS代替LPS注射。考虑到大鼠缺乏NRIR基因，通过载体（如纳米颗粒或腺病毒介导的siRNA转移）直接敲低是不可行的。参考先前的研究，我们选择巨噬细胞分泌的上清液（SN）作为培养基来研究NRIR在动物模型中的作用。si-NC-SN组的大鼠接受来自转染非靶向siRNA的M1巨噬细胞的SN，而si-NRIR-SN组的大鼠接受来自转染NRIR siRNA的M1巨噬细胞的SN。每3天向种植体周围的颊侧和舌侧牙龈注射SN（200 µL），持续2周。注射后四周处死大鼠，并收获组织进行分析。

2.11 微型计算机断层扫描

使用微型CT扫描上颌骨。使用Mimics（版本21.0）软件分析三维（3D）重建。通过测量远中、近中、颊侧和腭侧位置从最冠方边缘骨位置到根方种植体头端的距离来评估种植体周围骨丢失。根据Huang等人概述的微型CT分析指南，量化骨矿物质密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁分离度（Tb.Sp）和骨小梁数量（Tb.N）。

2.12 免疫组织化学分析

上颌牙槽骨标本用4%多聚甲醛固定，并在10%乙二胺四乙酸（EDTA）中脱钙6周。随后，将标本切成4 µm切片（近远中方向），用5% BSA封闭1小时，并根据制造商方案与一抗在4°C下孵育过夜。然后将切片与DAB显色溶液孵育，用苏木精复染（3分钟），并在Olympus BX51显微镜下观察。使用ImageJ软件（v1.8.0）进行半定量分析。通过计算阳性染色区域的积分光密度（IntDen）与面积的比值来量化染色强度（AOD = IntDen/Area）。

2.13 统计分析

使用双尾Student t检验或单因素方差分析（ANOVA）评估统计学显著性。当ANOVA显示显著差异时，进行Student-Newman-Keuls q（SNK-q）事后检验以识别具有统计学显著性的成对差异。不符合正态分布标准的变量使用Kruskal–Wallis H检验进行分析。使用SPSS软件（版本27.0）进行统计分析。定量数据表示为平均值±标准差（SD）。P < 0.05认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 LncRNA NRIR参与种植体周围炎中的M1巨噬细胞极化

在先前的研究中，高通量转录组测序在种植体周围炎患者的牙龈组织中鉴定出lncRNA NRIR。NRIR可能 critically 参与种植体周围炎症。此外，预测了七个基因（RSAD2, CMPK2, IFIT1, IFIT3, ISG15, BST2, and HLA-C）作为NRIR的潜在靶点。

由于巨噬细胞是种植体周围炎中的关键免疫细胞，我们假设NRIR可能调控巨噬细胞极化。为了验证这一假设，我们分析了M1巨噬细胞，观察到NRIR显著上调。接下来，我们使用特异性siRNA沉默NRIR，并评估其对M1巨噬细胞活化的影响。RT-qPCR结果表明，NRIR敲低后，M1相关基因（IL-1β, IL-6, iNOS, CD86, and CXCL10）显著下调。蛋白质印迹法证明NRIR敲低巨噬细胞中CD86蛋白表达降低。流式细胞术分析显示，NRIR敲低显著降低了M1极化，如CD86所示。此外，IF测定证实NRIR沉默显著抑制了M1巨噬细胞极化标志物（iNOS, CD86）的表达。

3.2 RSAD2是NRIR调控巨噬细胞极化的潜在靶点

为了进一步探索NRIR介导的巨噬细胞活化的机制，我们对NRIR敲低后的M1巨噬细胞进行了转录组微阵列和生物信息学分析。PCA和热图分析表明，对照组和NRIR敲低组之间的转录组谱存在明显差异，表明基因表达发生显著改变。差异表达分析确定了729个DEGs（357个下调，372个上调），通过火山图可视化。GSEA富集表明，NRIR敲低巨噬细胞中NF-κB信号通路普遍下调。此外，DEGs与预测的NRIR靶点之间的交集分析将RSAD2确定为唯一重叠的基因。初步表征表明，在NRIR敲低后，RSAD2在mRNA和蛋白质水平均下调，而RSAD2敲低不影响NRIR表达。因此，我们强烈怀疑RSAD2是NRIR在巨噬细胞极化调控中的潜在靶点。

3.3 RSAD2调控M1巨噬细胞极化

为了研究RSAD2在M1巨噬细胞中的作用，评估了RSAD2敲低巨噬细胞。在基因水平上，M1相关基因（IL-1β, IL-6, iNOS, CD86, and CXCL10）显著下调。在蛋白质水平上，RSAD2敲低巨噬细胞显示RSAD2和CD86表达降低。流式细胞术结果表明，RSAD2敲低显著降低了M1极化。此外，IF证实RSAD2沉默有效抑制了M1巨噬细胞极化标志物（iNOS, CD86）的表达。

3.4 LncRNA NRIR通过增强RSAD2基因表达促进M1巨噬细胞活化

为了确认NRIR是否通过调控RSAD2发挥其作用，进行了拯救实验。将靶向RSAD2的质粒转染到已确认NRIR敲低的THP-1巨噬细胞中，以恢复RSAD2表达。结果表明，RSAD2过表达逆转了由NRIR敲低引起的M1巨噬细胞相关基因和蛋白质表达的降低。

3.5 敲低lncRNA NRIR通过下调RSAD2抑制巨噬细胞极化过程中的NF-κB信号

我们随后研究了巨噬细胞极化过程中NRIR调控的信号通路。GSEA表明NRIR敲低抑制了NF-κB信号通路。NF-κB通路对于M1巨噬细胞活化至关重要，特别是在调控炎症基因表达方面。蛋白质印迹分析评估了关键因子IκB和p65的磷酸化形式。结果显示，NRIR敲低降低了M1巨噬细胞中磷酸化IκB、磷酸化p65和CD86的水平。然而，用Diprovocim（一种有效的TLR1/TLR2激动剂，可激活下游NF-κB信号）处理细胞可逆转这种降低。

为了确认NRIR是否通过RSAD2调控NF-κB信号，我们评估了RSAD2敲低巨噬细胞。在M1活化过程中，RSAD2敲低巨噬细胞中磷酸化IκB、磷酸化p65和CD86的蛋白质水平降低。这些发现表明，NRIR缺失通过下调RSAD2抑制NF-κB信号，进一步减弱M1巨噬细胞极化。

3.6 具有NRIR敲低的巨噬细胞在体外促进BMSCs的成骨分化

巨噬细胞分泌的趋化因子和细胞因子调控MSC迁移和分化以促进骨再生。为了评估NRIR敲低巨噬细胞分泌的因子对BMSC成骨分化的影响，使用来自NRIR敲低M1巨噬细胞的条件培养基培养BMSCs。RT-qPCR和蛋白质印迹法显示，与对照组相比，NRIR敲低巨噬细胞上清液显著增加了BMSCs中成骨分化标志物（OCN, OPN, RUNX2）的表达。ALP染色表明，用NRIR敲低巨噬细胞上清液培养的BMSCs中ALP表达增强。ARS染色显示，用NRIR敲低巨噬细胞上清液培养的BMSCs形成更多的矿化结节。

3.7 来自NRIR敲低M1巨噬细胞的上清液减轻大鼠种植体周围炎模型的炎症和骨丢失

接下来，我们使用大鼠模型探讨了NRIR在种植体周围炎中的作用。临床观察显示，来自转染si-NC的巨噬细胞的上清液产生的临床表现类似于LPS诱导的种植体周围炎。然而，用来自转染si-NRIR的巨噬细胞的上清液治疗的大鼠炎症显著减轻。微型CT显示，si-NC-SN组和LPS组的骨丢失程度相当，而si-NRIR组的骨吸收显著降低。骨形态计量学分析表明，与si-NC-SN组相比，si-NRIR-SN组的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著增加，Tb.Sp降低。此外，组织学分析显示，LPS组和si-NC-SN组有相似的炎症浸润和骨吸收，而si-NRIR-SN组的炎症细胞因子表达（IL-1β, IL-6, TNF-α）降低，成骨标志物表达（RUNX2, OPN, OCN）升高。总之，NRIR敲低改变了上清液的组成，减轻了种植体周围炎症和骨丢失。

4 讨论

在过去的几十年里，lncRNAs因其不编码蛋白质而被视为转录"垃圾"。然而，最近的研究表明，lncRNAs在癌症、炎症和心血管疾病中差异极化巨噬细胞的活化和功能中起关键作用。本研究确定了lncRNA-NRIR，它调控RSAD2并在M1巨噬细胞活化过程中高表达。使用功能缺失方法，确定NRIR是种植体周围炎中M1巨噬细胞活化的正调控因子。NRIR通过RSAD2促进NF-κB活化，降低BMSCs中的成骨相关因子，并促进种植体周围炎中炎症诱导的骨吸收。这些发现提示了M1巨噬细胞活化的新调控通路，为种植体周围炎的发病机制提供了新的见解。

NRIR位于染色体2p25.2上，与I型IFN通路密切相关。先前研究已将NRIR确定为系统性红斑狼疮（SLE）的潜在生物标志物，它可能促进疾病进展。然而，其在其他疾病，特别是巨噬细胞相关疾病中的作用和分子机制仍知之甚少。最近的一份报告表明，NRIR在Mtb感染期间的巨噬细胞中被强烈诱导。在本研究中，NRIR在LPS/IFN-γ刺激的M1巨噬细胞中同样被诱导。

RSAD2是一种干扰素刺激基因（ISG），编码具有抗病毒活性的蛋白质viperin。新兴研究强调了RSAD2/viperin在免疫调节和线粒体代谢中的关键作用。尽管RSAD2表达在极化的人THP-1和小鼠RAW264.7巨噬细胞模型中显著增加，但其在M1巨噬细胞活化中的确切作用仍不清楚。我们的研究揭示了RSAD2/viperin参与M1巨噬细胞活化。此外，基于先前的高通量测序数据和Cao等人的发现，我们验证了NRIR调控RSAD2，影响巨噬细胞极化。

作为关键的炎症调节因子，核因子κB（NF-κB）促进促炎细胞因子基因的转录。先前研究证实NF-κB信号调控巨噬细胞极化。来自NRIR敲低M1巨噬细胞的转录组分析表明NF-κB信号显著下调。随后的实验提供了强有力的证据，表明NRIR通过RSAD2激活NF-κB信号。

免疫和骨骼系统通过交换细胞因子、转录因子和信号受体参与种植体周围炎。巨噬细胞作为关键免疫细胞，特异性调控骨稳态。相反，BMSCs作为主要的成骨细胞祖细胞，在适当条件下分化为成骨细胞，增强成骨作用。促炎性M1巨噬细胞分泌各种细胞因子（TNF-α, IL-1, IL-12, IFN-γ）、趋化因子和基质金属蛋白酶，促进破骨细胞生成、组织侵蚀和进行性骨破坏。基于此原理，利用来自M1巨噬细胞的上清液诱导种植体周围炎。结果显示，si-NC巨噬细胞上清液诱导的种植体周围炎导致的骨丢失程度与LPS诱导的相当。然而，低浓度的TNF-α（20 ng/mL）可促进有利的成骨结果。在我们的实验中，从NRIR敲低M1巨噬细胞获得的上清液增强了BMSCs中成骨分化标志物的表达，并在体内减轻了种植体周围的炎症和骨丢失。这种有益效果可能归因于促进BMSCs向成骨细胞分化的细胞因子浓度的改变。

在临床环境中，如何通过靶向NRIR有效治疗患者是一个重要的考虑因素。近年来，通过siRNA诱导的RNA干扰技术实现了基因敲低，为各种疾病的创新治疗开辟了新途径。尽管基于siRNA的治疗具有重大前景，但其临床应用需要解决靶向递送、脱靶效应和免疫原性方面的局限性。目前采用了几种策略来克服这些挑战。研究表明，病毒载体、脂质纳米颗粒、化学修饰或tri-GalNAc缀合物可以精确地将寡核苷酸递送到靶位点。在种子区域的特定核苷酸位点替换2’-O-Me可有效抑制siRNA的脱靶活性。设计具有特定结构修饰的siRNA分子可以减少免疫激活。因此，靶向NRIR的siRNA代表了一种有前途的种植体周围炎治疗策略。

然而，这项研究有几个局限性。首先，使用的THP-1细胞系不能完全反映种植体周围炎中原发性巨噬细胞的行为。其次，尽管大鼠种植体周围炎模型是理想的，但它不能完全复制人类种植体周围炎的病理学。鉴于这些局限性和不足，未来的研究应侧重于原代人巨噬细胞，并通过非人灵长类动物模型进一步探索这些发现。

总之，本研究阐明了NRIR/RSAD2/NF-κB通路调控M1巨噬细胞活化，提示了种植体周围炎预防和