乙烯基砜交联剂拓展交联质谱工具箱：新型可富集、酸裂解和质谱裂解交联剂的开发与应用

本文推荐研究人员为克服传统NHS酯交联剂与含胺缓冲液不兼容、反应残基有限等局限性，开展了新型乙烯基砜交联剂的研究。他们成功开发了可富集的同双功能交联剂Alkyne-BVSC和异双功能光交联剂VSD，证实其在富胺环境中保持活性，并能与半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸反应，显著拓展了可交联残基范围。同时，他们建立了基于"存根"的搜索后过滤策略，提升了交联肽段鉴定的灵敏度。该研究为结构蛋白质组学提供了互补且 versatile 的新工具。

在探索蛋白质三维结构和相互作用网络的科学前沿，交联质谱（Crosslinking Mass Spectrometry, XL-MS）技术扮演着至关重要的角色。该技术通过化学交联剂在空间距离接近的氨基酸残基之间引入共价连接，再结合质谱分析，能够获得用于分子建模的距离约束信息。然而，长期以来，该领域广泛使用的交联剂，如二琥珀酰亚胺基磺氧化物（DSSO）和双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（BS³），大多依赖于N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯作为反应基团。这类交联剂主要靶向赖氨酸残基和蛋白质N末端，存在明显局限性：它们极易被游离胺（如常见的Tris缓冲液、ATP等生化辅助因子）淬灭，从而限制了其在许多重要生化环境中的应用，并且其可交联的残基类型也相对单一。因此，开发具有新反应活性、更好兼容性的交联剂，是拓展XL-MS技术应用边界的关键挑战。

在此背景下，由Anthony Ciancone、Francis J. O’Reilly等领导的研究团队在《Molecular 》上发表了他们的最新成果。他们将目光投向了乙烯基砜（Vinyl Sulfone）这一机制独特的亲电试剂。乙烯基砜已被证明能够与蛋白质上的半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸反应，并且其形成的键在质谱的HCD（Higher-energy Collisional Dissociation）碎裂过程中具有可裂解的特性。然而，乙烯基砜在交联剂领域的潜力尚未被充分挖掘，特别是在可富集性、异双功能设计以及适用于复杂样品的数据分析策略等方面仍存在大量未知。本研究旨在系统性地开发新一代乙烯基砜交联剂，解决现有工具的不足，并将其确立为结构蛋白质组学中一个强大而互补的新平台。

为达成研究目标，作者团队运用了多项关键技术。在化学合成方面，他们设计并合成了包括同双功能交联剂Alkyne-BVSC（含酸裂解炔烃手柄）和异双功能光交联剂VSD（结合乙烯基砜和重氮啶）在内的多种新型交联剂。在生物化学验证中，他们使用了凝胶电泳分析来评估交联剂的蛋白交联效率、缓冲液兼容性以及酸裂解特性。核心的交联质谱分析则基于高分辨率 Orbitrap 质谱仪，采用阶梯碰撞能HCD碎裂模式。数据分析流程依托于Xi软件套件（xiSEARCH, xiFDR）进行交联肽段鉴定和错误发现率（FDR）控制，并创新性地开发了基于"存根"（Stub）的搜索后过滤策略以提升鉴定灵敏度。研究涉及的生物样本包括纯化的人血清白蛋白（HSA）、酵母烯醇酶、通过PSMD2（RPN1）标签从人结肠癌细胞系HCT116中内源性纯化的26S蛋白酶体复合物，以及用于原位交联探索的HeLa细胞和大肠杆菌。

设计可富集、酸裂解且质谱裂解的乙烯基砜交联剂

研究人员首先合成了四种同双功能乙烯基砜交联剂（BVSS-Me, BVSS-Et, BVSS-Ph, Alkyne-BVSC），它们均包含酸裂解模块和一个炔烃手柄，便于通过点击化学连接生物素进行后续富集。凝胶实验证明，这些交联剂能够在溶液中对α-烯醇酶进行有效交联，形成二聚体。关键的是，与NHS酯交联剂DSBSO相比，Alkyne-BVSC在含有Tris、铵 bicarbonate、ATP、ADP等添加物的环境中仍能保持交联活性，仅被含硫醇的化合物（如DTT、GSH、TCEP）淬灭。通过连接四甲基罗丹明（TAMRA）并观察酸处理后的荧光信号变化，研究人员证实了这些交联剂具有可调控的酸裂解特性，其中Alkyne-BVSC在质谱样品制备常用的酸性条件下（如pH 3的C18除盐）即可发生有效裂解，生成222.27 Da的单链接修饰，这为其在XL-MS工作流中的应用奠定了基础。

优化乙烯基砜交联剂的HCD碎裂和数据过滤策略

乙烯基砜与残基（Cys, His, Lys）形成的键在HCD条件下可通过逆迈克尔加成反应断裂，释放出未修饰的肽段，但这会导致交联位点信息的丢失。为解决这一问题，并利用其MS可裂解的特性，研究人员提出将断裂后留在肽段上的乙烯基砜部分视为"存根"，作为真实交联谱图的有力证据。他们在不同低能HCD（9-21 NCE）条件下采集Alkyne-BVSC交联HSA的数据，并测试了五种搜索后过滤方法。结果表明，在低能HCD为18或21时，采用最宽松的"存根"过滤方法（方法C，允许双肽段均有5个存根碎片匹配）能显著提升复杂样品（如蛋白酶体Pull-down）中交联肽段的鉴定数量，使蛋白间唯一残基对（URPs）鉴定数增加84%。同时，Alkyne-BVSC提供了与DSSO（NHS酯交联剂）互补的交联覆盖范围，能够捕获到赖氨酸-半胱氨酸、赖氨酸-组氨酸等新型残基对组合。

Alkyne-BVSC交联肽段的高效亲和富集

研究人员验证了Alkyne-BVSC的交联肽段富集效率。他们将交联后的HSA通过CuAAC反应连接上脱硫生物素，并利用链霉亲和素珠进行富集。结果表明，富集步骤能显著降低非交联肽段的背景信号，使交联肽段的鉴定率大幅提升。即使在交联的HSA肽段中混入等量的E. coli肽段进行富集，依然能鉴定到大量HSA特异的交联位点，证明了该富集策略的有效性和特异性。

乙烯基砜交联剂被细胞内谷胱甘肽淬灭

尽管细胞成像显示Alkyne-BVSC能有效进入HeLa细胞并在胞质中分散，但原位交联质谱分析却在HeLa和E. coli细胞中只检测到极少量交联。通过开放修饰搜索，他们发现大量肽段携带一个1056 Da的修饰，这与Alkyne-BVSC与细胞内高浓度（毫摩尔级）的谷胱甘肽（GSH）反应产物的质量相符。这解释了其在细胞内交联效率低下的原因，表明乙烯基砜交联剂在活细胞应用方面面临GSH淬灭的挑战。

新型乙烯基砜-重氮啶异双功能交联剂：VSD

为了结合光交联的高时空精度和乙烯基砜的残基多样性，研究人员合成了异双功能交联剂VSD。该交联剂一端是乙烯基砜，另一端是UV激活的重氮啶。在HSA和蛋白酶体Pull-down样本中，VSD成功鉴定出大量结构合理的交联（78%的HSA交联满足25Å距离约束），并提供了与NHS酯-重氮啶交联剂SDA互补的残基对覆盖。虽然VSD的反应性低于SDA（鉴定到的交联数量较少），但它成功地将交联空间拓展至传统NHS酯难以触及的蛋白区域。

本研究系统性地开发并表征了一类新型乙烯基砜交联剂，成功将其确立为交联质谱技术中一个强大而互补的工具。这些交联剂不仅克服了传统NHS酯试剂在缓冲液兼容性上的主要限制，更重要的是，它们将可交联残基的范围从赖氨酸拓展至半胱氨酸和组氨酸，从而能够揭示蛋白质结构和相互作用中此前难以捕捉的信息。研究人员还创新性地提出了基于"存根"的搜索后过滤策略，有效提升了乙烯基砜交联肽段的鉴定灵敏度，为处理复杂样品的XL-MS数据分析提供了新思路。尽管细胞内高浓度谷胱甘肽对乙烯基砜的淬灭效应限制了其当前在活细胞原位研究中的应用，但这项工作无疑为未来开发具有更佳生物相容性的交联剂指明了方向。特别是异双功能交联剂VSD的成功展示，凸显了结合不同反应活性基团以最大化交联覆盖度的巨大潜力。总之，该研究极大地丰富了结构蛋白质组学的化学工具箱，为更全面、更精细地解析生命分子的三维结构和动态网络提供了新的可能。