伯氏疟原虫裂殖子蛋白PbGAC在红细胞侵袭中通过结合硫酸乙酰肝素介导宿主-病原体互作

本研究针对疟原虫入侵宿主红细胞的关键分子靶点不明问题，聚焦伯氏疟原虫滑行体关联连接蛋白PbGAC的功能解析。通过重组蛋白免疫、免疫共沉淀、钙离子调控实验及肝素结合分析，发现PbGAC定位于裂殖子顶端，依赖钙信号转位，与MSP1、MAP1等入侵相关蛋白互作，并通过结合红细胞表面硫酸乙酰肝素（HS）介导初始黏附。被动免疫实验证实其抗体可显著延长感染小鼠生存期，为靶向宿主-病原体互作的抗疟策略提供新靶点。

疟疾，这一由疟原虫引起的古老传染病，至今仍在全球范围内造成严重的公共卫生负担。疟原虫的生命周期复杂而精巧，其中，血液阶段裂殖子对红细胞的入侵是疾病发生的关键环节。这一过程依赖于一系列精细的分子“握手”：疟原虫利用其表面的配体与红细胞膜上的特定受体结合，从而启动入侵程序。在众多可能的受体中，红细胞表面的硫酸乙酰肝素（Heparan Sulfate, HS）等糖胺聚糖被认为扮演着重要角色，如同是红细胞为疟原虫预留的“分子门把手”。然而，究竟是疟原虫的哪些蛋白分子负责识别并抓住这个“门把手”，其具体机制和功能重要性仍有待深入揭示。这不仅是理解疟原虫致病机理的核心基础科学问题，也为开发阻断入侵的新型抗疟策略提供了潜在靶点。

近期，发表在《Parasites & Vectors》的一项研究，将目光投向了一个名为PbGAC（Plasmodium berghei glideosome-associated connector）的蛋白。该研究旨在阐明PbGAC在伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）裂殖子入侵红细胞过程中的分子功能，特别是其是否参与以及如何介导与硫酸乙酰肝素的相互作用。研究团队通过一系列实验证实，PbGAC是一个定位于裂殖子顶端和细胞质的肝素结合蛋白，其分布受钙离子信号调控，并能与多个已知的入侵相关蛋白相互作用，更重要的是，它能特异性结合红细胞表面的HS，而针对该蛋白的抗体能够有效抑制寄生虫入侵，为抗疟研究提供了新的视角和潜在的干预靶点。

为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术：利用原核系统表达并纯化PbGAC重组蛋白，用以免疫小鼠和大鼠制备特异性多克隆抗体；采用免疫荧光和蛋白质印迹进行PbGAC的亚细胞定位和表达分析；通过肝素-琼脂糖珠结合实验、肝素酶II处理红细胞结合流式细胞术和免疫荧光法，评估PbGAC与肝素及红细胞表面的结合特性；利用钙离子载体A23187和激酶抑制剂R59022处理裂殖子，研究钙信号对PbGAC分布的调控；通过免疫共沉淀结合质谱分析，筛选与PbGAC相互作用的蛋白质网络；最后，通过主动免疫（重组蛋白免疫）和被动免疫（免疫血清转移）小鼠攻毒实验，评估PbGAC特异性抗体的体内保护效果。研究所用寄生虫为伯氏疟原虫ANKA株，实验动物为BALB/c小鼠和SD大鼠。

PbGAC是顶复门原虫中一个进化保守的蛋白

研究人员首先通过生物信息学分析发现，PbGAC的氨基酸序列在疟原虫物种间高度保守，与约氏疟原虫（P. yoelii）、夏氏疟原虫（P. chabaudi）等的同源物一致性超过90%，与感染人类和猿类的疟原虫物种同源物的一致性也超过70%。系统发育分析表明，PbGAC与约氏疟原虫的亲缘关系最近。

PbGAC主要表达于裂殖子顶端区域和细胞质

为了探究PbGAC在寄生虫体内的表达和定位，研究团队成功制备了针对PbGAC的特异性抗体。蛋白质印迹分析证实该抗体能特异性识别天然的PbGAC蛋白。进一步的间接免疫荧光实验显示，PbGAC在环状体阶段检测不到，从滋养体阶段开始出现，并在裂殖子阶段，PbGAC主要定位于细胞质，并在裂殖子的最顶端区域有明显的聚集，这提示PbGAC可能在裂殖子的功能中扮演关键角色。

PbGAC在寄生虫内的分布受钙离子调控

寄生虫的发育依赖于钙离子依赖的信号通路，该通路影响宿主细胞入侵和从宿主细胞中逸出的过程。研究人员使用钙离子载体A23187和钙依赖性DGK1激酶抑制剂R59022处理裂殖子，观察PbGAC的分布变化。他们发现，在A23187诱导的寄生虫逸出后，PbGAC会聚集在裂殖子的基底端。而当同时存在DGK抑制剂R59022时，PbGAC从顶端向基底端的转运被抑制。这表明PbGAC的分布和转位受到钙离子信号的精密调控。

PbGAC与入侵相关蛋白存在相互作用

为了深入探索PbGAC的功能，研究人员利用PbGAC特异性抗体对同步化的伯氏疟原虫裂殖体期蛋白质进行免疫共沉淀，并结合质谱分析来寻找与PbGAC相互作用的蛋白质。结果鉴定出超过300种蛋白质。其中，网织红细胞结合蛋白、高分子量棒状体蛋白2（RhopH2）、RhopH3、肌动蛋白I（actin I）以及一个转运蛋白（SEC24A）等被发现与PbGAC共沉淀。此外，裂殖子附着蛋白（MAP1）、裂殖子表面蛋白1（MSP1）、疟原虫输出蛋白（PHIST）和输出蛋白（EXP2）等也与PbGAC存在相互作用。免疫荧光实验同时使用PbGAC和MSP1特异性抗体，证实了这两个分子在裂殖子表面的共定位，提示了它们之间潜在的相互作用。随后的共免疫共沉淀实验进一步证实了MSP1和PbGAC之间存在相互作用。这些发现为PbGAC参与伯氏疟原虫裂殖子红细胞入侵相关的蛋白质相互作用提供了有力证据。

PbGAC特异性结合肝素

基于PbGAC氨基酸序列中存在几个肝素结合基序，研究人员推测PbGAC可能作为入侵配体，通过与红细胞表面的硫酸乙酰肝素（HS）相互作用来发挥功能。为了验证这一假设，他们表达了GST-PbGAC和GST融合蛋白进行肝素结合实验。结果表明，重组蛋白GST-PbGAC表现出特异性的肝素结合活性，而GST蛋白则没有。此外，肝素能够以剂量依赖的方式抑制PbGAC与肝素的结合，而硫酸软骨素（CSA）则没有这种效果，证明了结合的特异性。

PbGAC特异性结合小鼠红细胞

研究人员进一步检测到PbGAC可分泌到培养上清液中。为了阐明PbGAC在红细胞上的结合特性及其生物学功能，他们使用GST-PbGAC进行了结合实验。将GST-PbGAC和GST分别与小鼠红细胞孵育，然后通过免疫荧光、蛋白质印迹和流式细胞术分析结合在红细胞表面的蛋白质。免疫荧光和蛋白质印迹均证明GST-PbGAC能特异性结合到小鼠红细胞上，而GST则不能。流式细胞术进一步证实了这一结果。为了确认PbGAC是介导肝素相互作用的关键，研究人员在用GST-PbGAC孵育红细胞前，先用肝素酶II预处理红细胞，以去除红细胞表面的硫酸乙酰肝素。结果发现，肝素酶II预处理降低了GST-PbGAC与红细胞的结合亲和力。这些发现表明GST-PbGAC能特异性结合红细胞表面，且这种结合依赖于硫酸乙酰肝素。同样，天然的PbGAC也能直接结合肝素和小鼠红细胞。

接种重组PbGAC的小鼠对伯氏疟原虫感染表现出抵抗力

为了评估PbGAC特异性抗体是否能提供体内保护作用，研究人员用PbGAC-His蛋白加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠，对照组只注射弗氏佐剂。当血清中PbGAC特异性抗体效价达到1:32,000时，给小鼠腹腔注射1x10⁶个伯氏疟原虫感染的红细胞。结果显示，与对照组相比，PbGAC免疫组小鼠的存活时间显著延长。此外，进行被动免疫实验，给小鼠静脉注射一次免疫血清或PBS对照。第二天，所有小鼠均用1x10⁶个伯氏疟原虫感染的红细胞进行攻毒。结果与主动免疫实验一致，接受抗PbGAC血清的小鼠比对照组存活时间更长。这些发现表明，PbGAC抗体能够赋予机体抵抗伯氏疟原虫感染的保护力。

综上所述，本研究系统性地阐明了伯氏疟原虫蛋白PbGAC在裂殖子入侵红细胞过程中的关键作用。研究结论指出，PbGAC是一个主要表达于裂殖子细胞质和顶端区域的蛋白，其分布受钙离子调控，并能与包括MSP1在内的多个入侵相关蛋白相互作用。最重要的是，PbGAC能够特异性结合红细胞表面的硫酸乙酰肝素受体，这表明它参与了一种保守的疟原虫入侵机制。PbGAC在入侵过程中的重要性得到了其与多个入侵相关蛋白的强相互作用以及特异性抗体所赋予的保护作用的证实。

该研究的讨论部分强调了这些发现的意义。PbGAC在裂殖子入侵早期附着中的作用符合复杂的分子标准：它定位于裂殖子细胞质和顶端区域，在疟原虫物种间高度保守，并且对HS结合表现出显著的特异性。PbGAC与已知入侵蛋白（如MSP1、MAP1等）的相互作用网络，以及与钙信号调控的关联，将其置于入侵过程的中心位置。该研究不仅增进了对疟原虫入侵生物学的理解，更重要的是，为系统性地功能表征疟原虫（包括恶性疟原虫）毒力因子建立了一个实验框架。靶向PbGAC与硫酸乙酰肝素相互作用的策略，有望为开发针对宿主-病原体相互作用的新型抗疟疗法开辟道路，可能加速抗疟药物的研发进程。