肥胖通过mt-dsRNA-PKR轴激活NLRP3炎症小体加速椎间盘退变的机制研究

本研究针对肥胖相关椎间盘退变(IVDD)的分子机制，揭示了饱和脂肪酸通过诱导线粒体损伤，释放mt-dsRNA激活PKR，进而促进NLRP3炎症小体介导的髓核细胞焦亡的新通路。研究人员通过体内外实验证实PKR缺失可缓解IVDD，并发现二甲双胍通过保护线粒体抑制该通路，为IVDD的防治提供了新靶点和治疗策略。

腰痛是全球范围内导致残疾的首要原因，而椎间盘退变(IVDD)被认为是其最重要的病理基础。随着肥胖人群的不断扩大，肥胖与IVDD的关联日益受到关注。传统观点多将肥胖相关IVDD归因于机械负荷增加，然而，越来越多的临床证据表明，即使排除机械因素，肥胖仍然是IVDD的独立危险因素，这提示代谢紊乱可能在IVDD的发生发展中扮演着关键角色。肥胖患者常伴有血脂异常，循环脂肪酸水平升高，这种代谢压力如何影响椎间盘髓核(NP)细胞的功能，进而导致细胞外基质(ECM)降解和炎症微环境形成，其具体分子机制尚不清晰。

为了解决这一科学问题，来自河北省沧州中西医结合医院骨科的研究团队在《Journal of Orthopaedic Surgery and Research》上发表了他们的最新研究成果。该研究旨在深入探究肥胖诱导的代谢应激如何触发髓核细胞的炎症反应和退变，并寻找潜在的治疗干预靶点。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：利用高脂饮食(HFD)喂养的小鼠构建肥胖相关的IVDD体内模型；分离培养小鼠原代髓核细胞，并使用棕榈酸(PA)模拟高脂环境进行体外刺激；通过PKR基因敲除(PKR^-/-)小鼠和药理学抑制剂(2-AP)来验证PKR的功能；采用蛋白质免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光和免疫组织化学技术检测蛋白表达与定位；通过交叉linking免疫沉淀测序(CLIP-seq)技术鉴定与PKR相互作用的RNA种类；使用JC-1染料检测线粒体膜电位以评估线粒体功能；并探讨了糖尿病药物二甲双胍对IVDD的干预效果。

PKR在高脂饮食诱导的IVDD中被激活

研究首先证实，与常规饮食(RD)组相比，HFD喂养6个月和14个月的小鼠均成功诱导出肥胖表型，并伴有空腹血糖、非酯化脂肪酸和甘油三酯水平的显著升高。影像学和组织学分析（Safranin-O/fast green染色）显示，HFD组小鼠椎间盘高度指数(DHI)显著降低，椎间盘呈现明显的退行性改变。

分子水平上，HFD组髓核组织中ECM主要成分胶原II（Collagen-II）和聚集蛋白聚糖（ACAN）表达下调，而基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5表达上调。同时，炎症因子IL-1β、caspase-1的活化以及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的核外释放均显著增加。值得注意的是，磷酸化PKR（p-PKR）的水平在HFD组髓核组织中明显升高，提示PKR的激活可能与HFD诱导的IVDD相关。

PKR在棕榈酸介导的髓核细胞焦亡中的作用

在体外实验中，使用饱和脂肪酸棕榈酸(PA)处理小鼠原代髓核细胞，模拟肥胖下的代谢应激环境。结果显示，PA处理能诱导髓核细胞退变表型，即合成代谢基因（ACAN, Collagen-II）表达下调，分解代谢基因（MMP-13, ADAMTS-5）表达上调，而PKR敲除可显著缓解此表型。PA处理促进了PKR的磷酸化激活，并引发HMGB1从细胞核向胞质的释放，这是细胞焦亡的标志性事件之一。

p<0.05,p<0.001 by Student's t test,n=3,E intracellular HMGB1, visualized with red immunofluorescence staining, is predominately localized in the nucleus in NP cells. Following by exposure to palmitic acid,nuclear HMGB1 is released from the nucleus to the cytoplasm and knock off PKR significantly inhibited HMGB1 release. HMGB1(red), DAPI(blue), scale bar=50μm;F Caspase-1 activation and IL-1β cleavage were assessed by Western blot,n=3.PKR+/+ or PKR-/- NP cells were stimulated as indicated.G,H) PKR+/+ or PKR-/- NP cells were treated with palmitic acid as indicated; Supernatant was detected by ELISA. Cytotoxicity was determined by LDH assay,p<0.05,*p<0.001 by Student's t test,n=3,I the scanning electron microscopy showed that membrane pore-forming was increased by palmitic acid and PKR knock off decreased the membrane pore-forming in NP cells induced by palmitic acid; scale bar=20 um(below: magnification of the tetrago-num; scale bar=2μm).PA:palmitic acid'>

进一步研究发现，PA处理促进了caspase-1的活化和IL-1β的成熟切割，而PKR敲除则能显著抑制这一过程。乳酸脱氢酶（LDH）释放实验和扫描电镜观察证实，PA诱导了髓核细胞的焦亡（表现为细胞膜孔洞形成），且该效应依赖于PKR的存在。

PKR调控NLRP3炎症小体在髓核细胞焦亡过程中的激活

NLRP3炎症小体是调控IL-1β成熟和释放以及caspase-1活化的关键平台。本研究通过基因过表达和药理学抑制（使用PKR抑制剂2-AP）实验证实，PKR的活性对于PA诱导的NLRP3炎症小体激活至关重要。过表达PKR能促进caspase-1活化和IL-1β切割，而2-AP则能抑制PA的效应。

机制上，免疫共沉淀实验证明PKR与NLRP3存在直接的物理相互作用，且PA处理能促进PKR-NLRP3复合物的形成，2-AP则可抑制此过程。此外，PA处理增加了焦亡执行蛋白GSDMD的N端片段（GSDMD-N）和炎症小体适配蛋白ASC斑点的形成，进一步证实了NLRP3炎症小体的激活，而PKR抑制可逆转此现象。研究还排除了PKR下游因子eIF2α的介导作用，并发现PKR过表达在NLRP3缺失的情况下不能激活caspase-1和IL-1β，强调了PKR通过直接作用于NLRP3来调控炎症小体活性。

mt-dsRNAs是代谢应激下髓核细胞中与PKR相互作用的主要dsRNA类别

为探究PA激活PKR的上游信号，研究人员发现这一过程不依赖于Toll样受体4（TLR4）。然而，破坏PKR的RNA结合结构域（K64E突变）则完全阻断了PA诱导的PKR激活，提示内源性双链RNA（dsRNA）的参与。免疫荧光显示PA处理后胞质内dsRNA与PKR共定位增加。

关键的CLIP-seq分析发现，在HFD诱导的退变髓核组织中，与PKR相互作用的线粒体RNA（mtRNA）显著富集。体外实验证实，PA处理导致髓核细胞线粒体膜电位下降（线粒体损伤），胞质内总mtRNA以及双链mtRNA（mt-dsRNA，通过链特异性RT-qPCR证实）水平升高。使用线粒体RNA聚合酶抑制剂2-CM减少mtRNA合成后，PA诱导的胞质mt-dsRNA增加和PKR激活均被显著抑制。这些结果明确地将线粒体损伤后释放的mt-dsRNA确定为代谢应激下激活PKR的内源性触发器。

二甲双胍通过降低mt-dsRNA表达抑制PKR激活和髓核细胞焦亡

鉴于二甲双胍已知的抗炎和代谢调节作用，研究团队探讨了其是否能够干预上述新发现的通路。结果显示，二甲双胍预处理能显著减轻PA引起的线粒体膜电位损伤，降低胞质中mt-dsRNA的水平，进而抑制PKR的磷酸化。

相应地，HMGB1的释放、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟切割也均被二甲双胍有效抑制。这表明二甲双胍通过保护线粒体完整性，减少mt-dsRNA的泄漏，从而阻断了下游PKR-NLRP3炎症小体轴的激活，最终缓解了髓核细胞的焦亡。

二甲双胍抑制小鼠IVDD模型中的椎间盘退变

在体实验进一步验证了上述发现。PKR敲除小鼠即使接受HFD喂养，其髓核组织中IL-1β、caspase-1的表达和HMGB1的释放均未出现显著变化，椎间盘形态也得到良好保护，说明PKR是HFD诱导IVDD所必需的。

p<0.05,*p<0.01 by Student's t test,n=3,immunohistochemistry of p-PKR and PKR on the NP tissue of control, IVDD and metformin treatment(limit or delay) group,scale bar=20μm,n=3,J immunofluorescence staining for IL-1β(red), caspase-1(red) and GSDMD-N(red) in the IVD degeneration model mice treated with metformin(limit or delay).Nucleus(blue),scale bar=50μm,n=3,Kimmunofluorescence staining for collagen-II(red),aggrecan(red),MMP-13(red) and ADAMTS-5(red) in the IVD degeneration model mice treated with metformin(limit or delay).Nucleus(blue),scale bar=100μm,n=3'>

在椎间盘穿刺诱导的IVDD模型中，预防性或治疗性给予二甲双胍均能显著延缓椎间盘退变的进程，表现为椎间盘形态改善、ECM合成代谢相关基因（Collagen-II, ACAN）表达上调、分解代谢基因（MMP-13, ADAMTS-5）表达下调。同时，退变髓核组织中升高的mtRNA水平和PKR磷酸化被抑制，NLRP3炎症小体激活和相关炎症因子表达也显著降低。这些结果强有力地证明，二甲双胍通过靶向mt-dsRNA-PKR轴，在体内具有抑制IVDD发生和发展的潜力。

本研究首次系统地阐明了肥胖环境下，饱和脂肪酸通过诱导线粒体损伤，释放mt-dsRNA作为内源性危险信号，激活PKR，进而直接与NLRP3相互作用形成炎症小体复合物，最终导致髓核细胞焦亡和ECM代谢失衡的完整分子通路（mt-dsRNA-PKR轴）。该研究不仅深化了对IVDD，特别是代谢相关性IVDD发病机制的理解，将代谢应激、线粒体功能障碍、天然免疫激活和细胞程序性死亡等重要生物学过程紧密联系起来，而且创新性地提出了PKR作为连接肥胖与IVDD的关键分子节点。此外，研究证实了临床常用药物二甲双胍对于IVDD的潜在治疗价值，为其老药新用提供了重要的临床前证据，为开发针对IVDD的新的治疗策略奠定了坚实的理论基础。