长期固定对存档人神经组织转录组测序的影响：RNA可及性与数据可解释性研究

本研究针对脑库存档组织长期固定影响转录组测序准确性的关键问题，系统评估了福尔马林固定时间（2天至6年以上）对FFPE人脊髓和下丘脑样本在10X Genomics单细胞核RNA测序和空间转录组技术中的影响。研究发现长期固定虽不改变RNA完整性指标（RIN/DV200），但显著降低探针连接效率，导致基因检测数量减少和转录组数据稀疏化，严重影响疾病机制研究的可靠性。该成果为脑库组织处理标准化提供了关键实验依据。

在神经科学研究领域，脑库储存的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是探索神经退行性疾病机制的宝贵资源。然而由于存储条件和处理流程的差异，这些组织样本的固定时间存在巨大波动——从几天到数年不等。这种时间差异是否会影响到现代转录组测序技术的准确性，一直是研究人员担忧的技术瓶颈。

传统观点认为，甲醛固定能通过形成蛋白质-核酸交联键"冻结"生物分子状态，但过度固定可能导致RNA分子发生化学修饰，影响下游分析。虽然目前已有针对FFPE样本的RNA质量评估指标（如DV200和RNA完整性指数RIN），但这些指标主要反映RNA片段大小分布，无法评估分子可及性。随着单细胞核RNA测序（snRNA-seq）和空间转录组（Visium）等新技术的普及，明确长期固定对测序数据质量的影响具有迫切意义。

来自悉尼脑库的30例人源组织（包括下丘脑和腰脊髓样本）为这项研究提供了材料基础。这些样本来自C9ORF72基因相关疾病谱系患者：运动神经元病（MND）、行为变异型额颞叶痴呆（bvFTD）及其混合型（bvFTD-MND）。研究团队巧妙设计了不同固定时长（2天、14天、6年以上）的对比实验，分别进行10X Genomics平台的单细胞核测序（Chromium Next Gem Flex）和空间转录组（Visium）分析。

关键技术方法包括：采用Qiagen RNeasy FFPE Kit进行RNA提取，Agilent Bioanalyzer评估RNA质量；单细胞核测序遵循10X Genomics固定RNA分析方案，空间转录组采用Visium CytAssist技术；数据分析使用Seurat（v5.3.0）和线性混合效应模型，以供体身份作为随机效应变量，控制技术平台、解剖区域和疾病类型等固定效应。

质量指标分析显示传统RNA质量指标与固定时长脱节。虽然14天固定组的RIN值显著低于2天组（p=0.005），但长期固定（最长2580天）与DV200（p=0.349）或RIN（p=0.222）均无显著关联。然而转录组特异性指标呈现明显时间效应： confidently mapped reads百分比随固定时间急剧下降（p<0.001），每个核/点的中位数基因数显著减少（p=0.039）。

聚类与细胞类型注释结果凸显固定时长对数据解读的严重影响。2天固定的下丘脑样本成功鉴定出7-9种细胞类型（神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞等），而14天固定样本仅能识别2种细胞类型。空间转录组在14天固定脊髓样本中仍保持较好解析度，成功检测到运动神经元缺失等疾病特征差异。但超过6年固定的样本几乎丧失生物学信息，下丘脑样本因数据过于稀疏无法生成UMAP图谱。

主成分与标志基因表达分析进一步证实技术局限性。主成分解释方差与固定时长显著负相关（p<0.001）。关键神经标志基因（SNAP25、OLIG2、TMEM119等）表达量随固定时间延长显著降低，唯独GFAP表达异常升高，提示标准化过程可能在高稀疏样本中放大高表达基因信号。

这项研究系统揭示了长期固定对转录组测序的深层影响机制：甲醛固定虽不加速RNA降解，但通过分子交联和化学修饰严重阻碍探针结合效率。这种影响在单细胞分辨率技术中尤为突出，导致低丰度细胞类型和基因信号丢失。研究建议将RNA外显子捕获作为FFPE样本质控新标准，并呼吁脑库建立≤48小时短时固定规范。该成果为神经退行性疾病研究提供了重要技术标准，推动脑库样本处理流程与前沿测序技术的协同进化。