NOTCH信号通路是一种古老的、广泛表达的细胞信号系统，对于胚胎和后胚胎期细胞命运调控以及组织生长至关重要。它通过相邻细胞间受体和配体之间的细胞间相互作用被激活，这种相互作用释放了受体的潜在转录激活能力。受体的细胞内结构域通过蛋白水解切割后会转位至细胞核，并作为DNA结合的转录激活复合物的一部分直接刺激目标基因的表达。迄今为止，人们一直假设这一过程涉及配体同源二聚体与受体同源二聚体之间的相互作用。然而，本研究提供了多方面的证据，支持NOTCH受体二聚化/寡聚化（以下简称二聚化）对于受体信号转导是必要的观点。我们发现，(1) NOTCH受体可以在体外高效自聚，这种自聚是由受体胞外结构域的负调控区（NRR）中发现的一个短结构基序介导的；(2) 删除这个基序会破坏受体同源二聚化并阻止受体转导；(3) 针对这个二聚化基序的短肽同样会阻断受体二聚化和转导。由于NOTCH通路在多种疾病中出现紊乱，本文所揭示的NOTCH受体转导新机制以及发现的新型NOTCH信号抑制剂，可能为治疗这些疾病提供了新的治疗途径。在这一背景下，我们还展示了以T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）为中心的初步概念验证研究。
NOTCH信号通路自20世纪初在果蝇中首次被发现以来，就因其在动物组织生物学中的核心作用而受到广泛关注。随后，这一通路在多种物种中的分子机制和其在组织发育与维持中的关键作用被广泛研究，涵盖了从昆虫到人类的整个动物进化谱系。NOTCH通路的核心包括类型1跨膜受体和类型1跨膜配体。无脊椎动物，如果蝇，仅有一种NOTCH受体家族成员，由两个配体控制；而脊椎动物则编码多达四种不同的受体类型（NOTCH1-4）和五种不同的配体：JAGGED（JAG）1、JAG2、DELTA-LIKE（DLL）1、DLL3和DLL4。从果蝇到人类，NOTCH受体的整体结构保持相对稳定。成熟的异源NOTCH受体是大型蛋白质（超过300 kDa），由一个结合配体的胞外结构域和一个连接膜的细胞内部分组成，后者编码了受体的内在转录激活潜力。胞外结构域（ECD）构成了受体的大部分质量（约250 kDa），由一系列连接的表皮生长因子（EGF）样结构域组成：NOTCH1和NOTCH2编码36个这样的结构域，NOTCH3有34个结构域，NOTCH4有29个结构域。结构研究利用特定的ECD片段表明，受体的EGF样重复结构域可能作为与NOTCH配体的EGF样重复结构域及其他特定结构域相互作用的位点，而对于某些受体-配体组合，已经映射出多个这样的作用位点。
EGF样结构域通过一个连接膜的异二聚化结构域（通过该结构域将胞外部分和细胞内部分连接）以及三个连续的LIN-12/NOTCH重复结构域（LNRs）相互连接。这一区域被认为是NOTCH受体机械感受活性的核心组成部分，这一活性被认为是配体依赖的受体激活的基础。在没有配体的情况下，它被认为采用一种自抑制构象；而在配体结合后，通过拉力暴露一个被掩埋的ADAM金属蛋白酶S2切割位点，从而启动一系列蛋白水解事件，最终导致NOTCH受体目标基因的激活。值得注意的是，不同NOTCH受体同源物的NRR区域的结构分析显示，NRR倾向于形成倒镜像的二聚体，这些二聚体通过界面处的保守螺旋相互作用稳定，这可能有助于维持受体的自抑制“关闭状态”。这些分析还提供了关于异常NOTCH受体激活在如T-ALL等疾病中的机制基础的重要见解，其中NOTCH1的NRR中存在激活突变。
由于NOTCH通路在多种疾病中出现紊乱，因此过去二十年来，全球范围内一直致力于识别能够特异性阻断异常NOTCH信号传导的分子。这些努力已经产生了多种策略，包括直接针对受体及其配体的抗体，针对调节酶的小分子抑制剂，尤其是γ-分泌酶抑制剂（GSIs），以及针对翻译后修饰的小分子抑制剂，如糖基化和乙酰化，以及微小RNA。GSIs是第一个被用于临床测试的NOTCH受体抑制剂，并且一直是开发具有临床价值的治疗手段的前沿。然而，这些方法的一个主要缺点是其导致的显而易见的毒性，因为这些酶的底物数量众多（超过90个），并且大多数NOTCH受体同源物都被这些酶所靶向。此外，在组织生长和分化过程中，不同的NOTCH同源物在空间和时间上受到严格调控，执行特定的功能，这些功能可以是刺激性的或抑制性的，具体取决于上下文。同样地，根据肿瘤细胞或其在肿瘤微环境中的功能，NOTCH信号传导可以是肿瘤促进性的或肿瘤抑制性的。因此，全面阻断NOTCH信号传导可能会产生不可预测且不利的结果。
解决这些目前难以处理的问题的一个潜在方案是开发高度选择性的NOTCH受体激活抑制剂，这些抑制剂可以特异性地靶向每个NOTCH同源物。在这里，我们采取了生化方法重新审视NOTCH受体的转导过程。虽然已经表明转录活性的切割NOTCH细胞内结构域可以在DNA上组装成二聚体复合物，但在缺乏替代模型的情况下，人们普遍认为信号传导的启动是由基本上单体的受体/配体相互作用执行的。我们提供了证据表明，受体的二聚化对于转导是必要的。这一发现使我们能够识别出新型的、高度特异性的肽抑制剂，这些抑制剂可以阻断受体的二聚化和由此产生的受体转导。这些开创性的抑制剂可能揭示一种新的治疗策略，用于治疗NOTCH信号传导被破坏的疾病。
在研究NOTCH受体的自聚过程中，我们首先关注NOTCH3（N3）。图1A和1B显示了N3受体的胞外结构域和全长N3蛋白在体外和组织培养细胞中能够高效自聚。为了进一步解析受体的自聚，我们进行了全面的映射分析。尽管EGF样重复结构域似乎不介导受体-受体的结合，这与之前的研究一致，但图1C显示了靠近膜的区域与全长N3胞外结构域相互作用。N3的NRR在进化过程中高度保守，并与其他NOTCH受体家族成员具有显著的结构同源性。早期的NRR结构分析和计算机模拟都突出了一个核心的螺旋基序，该基序可能介导全长受体的自聚。为了进一步定义这一基序的潜在功能意义，我们设计了针对该序列的特定突变。图1D显示，针对潜在二聚化界面的单点突变不足以破坏自聚，而对螺旋的小规模删除则完全阻断了N3胞外结构域或全长N3蛋白的自聚。有趣的是，计算机模拟显示，在单体以头对头的构型结合时，该螺旋可以形成核心的二聚化界面，而删除该螺旋则会破坏整个复合物的结构完整性。为了验证这些生化证据，我们进行了邻近连接分析（PLA）以测试受体的二聚化。图1F和1G显示，稳定的NOTCH受体二聚化是在配体作用下触发的，并且删除二聚化基序（对受体的表达水平或细胞膜表达没有明显影响）会消除这种反应。
这些发现表明，NOTCH3的NRR中的一个短螺旋基序对于受体的二聚化是必要的。接下来，我们探讨了受体自聚的功能。图2显示，通过四种不同的方法，受体的同源二聚化对于受体的转导是必要的。其中，图2A显示，删除二聚化基序会阻断配体依赖的N3切割。此外，定量荧光素酶报告基因实验显示，配体依赖的NOTCH报告基因转导同样在删除二聚化基序后被阻断。相应地，对基序的点突变，这些突变不会阻断受体自聚，对受体依赖的报告基因激活没有明显的抑制作用。第三，图2D显示，二聚化基序对于配体依赖的内源性下游NOTCH目标基因激活是必要的。值得注意的是，删除该基序并未显著改变受体的细胞膜表达、全局亚细胞定位或受体蛋白稳定性。第四，与我们的PLA数据一致，删除二聚化基序会阻断细胞表面的配体-受体稳定相互作用。虽然NRR本身并不是NOTCH配体的结合位点，但图2G显示，受体的二聚化对于配体的高亲和力/稳定结合至关重要。
这些数据表明，受体的二聚化是NOTCH受体转导所必需的，而NRR中一个短的螺旋基序对于这一机制是必要的。接下来，我们设计了短（12–20个氨基酸）的肽，这些肽以二聚化界面为中心，以特异性阻断NOTCH受体的激活。图3显示，一种能够特异性结合二聚化基序的肽可以有效阻断受体的二聚化、配体依赖的受体切割以及NOTCH报告基因和下游NOTCH目标基因的转导。此外，该肽抑制剂的效率与通用的γ-分泌酶抑制剂（GSI）DAPT相当。同样地，与删除二聚化基序类似，该肽能够有效阻断细胞表面的配体-受体稳定结合。为了估算该肽与N3的结合亲和力，我们使用了表面等离子体共振（SPR）技术，利用纯化的、从人类细胞中纯化的重组N3胞外结构域。通过这些方法，我们确定了结合常数（KD）处于低纳摩尔范围。值得注意的是，一个对照肽，其中NRR核心序列的氨基酸被突变为甘氨酸，未能有效结合N3胞外结构域，这与基序对于肽-受体结合的必要性和充分性相一致。支持这些发现，纯化的重组N3胞外结构域二聚体在特定的N3肽抑制剂存在下被破坏（在肽抑制剂存在下，电泳迁移率对应于N3胞外结构域的单体），但对照肽未能做到这一点。此外，先前的研究虽然没有明确涉及NOTCH受体的二聚化，但表明针对NRR区域的抗体可以阻断NOTCH活性。
我们发现，所有NOTCH受体家族成员都包含NRR结构域，而该结构域的整体结构（包括二聚化基序）在进化过程中保持保守。然而，值得注意的是，尽管N3肽能够阻断N3受体的活性，但它对NOTCH2（N2）受体的切割、N2受体的二聚化、细胞表面稳定的N2受体-配体结合或N2受体的下游基因激活几乎没有可检测的影响。由于N3肽对N3表现出高度的选择性（对N2或N1没有影响），我们设计了针对N2和N1二聚化基序的肽，以特异性阻断N2和N1信号传导。图4显示，类似N3肽对N3信号传导的阻断，N2肽但不是N3或N1肽能够显著抑制N2受体的转导、配体介导的N2受体切割、N2受体的二聚化以及细胞表面稳定的配体-受体结合。与N3抑制剂的特异性一致，这些效应是N2受体特异性的，因为N2肽不能阻断N3或N1受体的转导。同样地，基于N1二聚化基序的肽能够有效阻断N1的转导，但未能显著抑制N2或N3受体的活性。此外，我们发现，针对NOTCH同源物的特异性抑制剂能够像通用的GSI抑制剂DAPT一样有效地阻断下游NOTCH目标基因的表达。
总的来说，这些发现支持了受体的二聚化/寡聚化是配体依赖的受体信号传导基础的观点。基于这一发现，我们识别出了一类新的、同源物特异性的NOTCH受体肽抑制剂，这些抑制剂可以阻断受体的自聚以及由此产生的受体转导。NOTCH信号传导网络在多种疾病中经常被破坏，因此我们的研究结果表明，这些肽可能在特异性靶向异常NOTCH信号传导方面具有潜在的治疗价值。例如，T-ALL细胞中由于NOTCH1的激活突变，其信号传导可能被这些肽所阻断。T-ALL是一种特别侵袭性的急性淋巴细胞白血病变种，可以作为此类研究的起点。广泛的全基因组分析已经确定NOTCH1（N1）受体的突变是大多数患者中最常见的突变之一。许多这些突变被报告为引发受体的非法超激活，这可能有助于该疾病的发展。因此，一种能够特异性靶向激活N1受体的分子预计能够抑制T-ALL细胞的存活。
图5总结了对六种不同来源的T-ALL细胞系的分析。其中四个细胞系携带N1激活突变：MOLT4（以及相关的MOLT3细胞系也进行了测试，结果相似），ALL SIL，DND-41和HPB-ALL。两个细胞系作为对照：SUP-T1细胞携带N1易位，导致ECD的几乎全部缺失，这将排除靶向NRR中的二聚化基序的可能性；而JURKAT细胞携带N1受体，其活性与其它T-ALL细胞系相比并不高。图5A和5B显示，N1肽显著抑制了携带N1激活突变的细胞系的存活，但未影响对照细胞系。在每种情况下，这些效应与广泛使用的化疗药物 vincristine（图5A）以及高浓度的通用GSI DAPT（图5B）进行了比较。相应地，该肽抑制剂在携带N1突变的细胞系中阻断了细胞周期进程，但未影响对照细胞系。此外，该肽抑制剂对下游N1目标基因的表达抑制程度与DAPT的效果相当。为了进一步理解在T-ALL细胞中激活N1受体靶向的机制基础，我们标记了MOLT4细胞表面的内源性N1受体。通过这些方法，观察到了两个N1受体群体：一个质量对应于单体N1受体的N1，以及一个更高分子量的可能对应于N1二聚体/寡聚体的N1。确实，MOLT4细胞中下游N1目标基因HEY的表达水平比JURKAT细胞高10到15倍。令人信服的是，我们发现，当细胞与对照肽孵育时，检测到的N1受体的模式和数量没有明显变化，而N1肽显著抑制了更高分子量的N1复合物的表达，这表明该肽可能通过部分阻断N1的自聚和随后的受体激活发挥作用。在对照JURKAT细胞中，该肽对N1受体没有明显的影响。
尽管历史上，白血病通常不被视为转移性疾病，但它具有异常的扩散和增殖能力，并能侵入多种不同组织。斑马鱼胚胎是一种监测这一现象的可行的体内系统，并特别适合测试这些过程的潜在抑制剂。图5F显示，N1肽但不是类似的对照肽显著且可重复地阻断了携带N1激活突变的人类T-ALL细胞进入非血管组织的侵袭。在这些条件下，这些肽只影响细胞的内渗和外渗，而不影响总体的细胞增殖，这符合预期，因为胚胎在相对低温下培养。这表明该肽可以抑制由激活NOTCH驱动的细胞增殖以及由激活NOTCH驱动的组织侵袭。
这些发现表明，一种高度特异性的N1肽能够选择性地抑制T-ALL细胞中表达的突变型、持续活跃的N1受体，从而显著抑制其增殖和侵袭潜力。确定该肽抑制剂是否能够同样阻断N1在其他肿瘤类型中的活性，以及肿瘤微环境中的成分，如肿瘤血管，将是一个重要的研究方向。此外，我们的N2和N3肽抑制剂也可能能够特异性地靶向和减弱某些已知疾病中特征性的非法NOTCH信号传导。
在本研究中，我们首次提供了证据，表明NOTCH受体的二聚化可能介导配体依赖的受体转导。我们的研究集中在三个人类NOTCH同源物（N1、N2和N3）上；然而，考虑到脊椎动物和无脊椎动物NOTCH受体和配体之间高度的结构相似性，这一机制可能是普遍适用的。事实上，果蝇NOTCH的ECD电子显微镜研究显示其能够形成二聚体。重要的是，对人类NOTCH受体结构域的结构研究识别了NRR中特定的序列，这些序列可以稳定倒镜像的NRR同源二聚体，这些二聚体被认为通过阻止蛋白酶接近被掩埋的蛋白酶切割位点，有助于维持NOTCH的“关闭状态”。在正常生理条件下，不清楚由于拓扑限制，这些倒置构型是否被同一细胞表面的受体采用，或者在完整的ECD结构中，是否可以建立不同的非倒置构型。在这方面，对NRR区域（仅包括LNR2和LNR3区域）的计算机模拟预测单体可以以头对头的构型结合，并揭示了核心二聚化界面。当失去二聚化基序时，该界面可能被破坏。我们的研究表明，NOTCH的二聚化是高效转导配体结合和随后的NOTCH受体激活的前提条件。这一观点对NOTCH信号传导有多个潜在重要的影响。迄今为止，NOTCH信号传导知识的一个主要空白，由于在体外和体内表征全长蛋白的技术困难，涉及配体、受体和受体-配体复合物的精确性质以及它们如何相互作用以产生由NOTCH网络调控的广泛细胞过程。最近的证据表明，配体的同源二聚化和异源二聚化可能在调节受体转导与跨抑制之间的平衡中发挥作用，这决定了受体的信号输出。受体的二聚化以及如何调控这一机制可以成为NOTCH信号输出的新控制点。相关地，尚不清楚跨受体-配体相互作用是否在构型上与同源受体-配体相互作用不同，并且在此背景下，确定受体二聚化是否有助于它们对受体活性的不同影响将具有价值。有趣的是，已经表明切割的NOTCH细胞内结构域可以与共因子在共识DNA结合位点上形成二聚体复合物，这种复合物对于某些组织的正常功能是不可或缺的。可能，这种机制可以通过细胞表面二聚化依赖的受体激活来促进或调节。
我们的发现还有另一个重要的影响，即揭示了之前可能被忽视的生物医学/治疗途径，用于理解和治疗多种疾病。鉴于NOTCH信号传导在组织发育和稳态中的核心作用，以及它在广泛疾病中的频繁紊乱，自NOTCH基因克隆和表征以来的40年里，特别是在精准医学和靶向治疗时代，全球范围内一直致力于识别NOTCH信号传导抑制剂。正如前所述，GSIs是当前临床试验的主要手段，尽管它们的显而易见的毒性仍然是一个严重的问题。我们的研究提供了一种独特的替代解决方案，即高度特异性的肽，这些肽以NOTCH二聚化界面为中心，以NOTCH同源物特异性的方式阻断NOTCH受体信号传导。在本文中，作为这种新方法的初步验证，我们检查了肽对T-ALL的影响，T-ALL是一种以大多数患者中NOTCH1的激活突变为特征的侵袭性癌症。我们展示了N1肽能够像强力的通用GSI DAPT一样有效地阻断肿瘤细胞增殖、组织侵袭和下游基因激活。显著的是，该肽未能影响T-ALL细胞，这些细胞表现出非超激活的N1受体活性，这表明它可能特异性地靶向异常激活的N1。这些发现表明，高度特异性的N1肽抑制剂可以单独或与其他药物联合使用，以靶向携带激活N1突变的T-ALL肿瘤。鉴于该肽的极高度选择性，这种方法可以显著限制目前使用的化疗药物和通用GSIs的显而易见的毒性。除了T-ALL，被破坏的NOTCH信号传导已被报告在多种其他癌症中起作用，包括肿瘤细胞和肿瘤基质的生物学过程，如肿瘤血管。肿瘤血管生成是肿瘤发生的关键步骤，使癌细胞能够通过连接肿瘤与循环系统来逃避细胞增殖的代谢限制，从而促进其生长和转移。然而，肿瘤血管生成在定量和定性上与正常血管生成不同；然而，假定不同NOTCH受体和配体之间的复杂相互作用在肿瘤毛细血管生成中起着基本作用。由于上下文相关的NOTCH受体激活/抑制可以产生相反的效果，这种相互作用的可能结果是，通用的NOTCH信号传导抑制剂（如GSIs）可能引发意外（且不希望的）结果。直接靶向在血管生成中发挥不同作用的特定NOTCH同源物，可能有助于克服这些问题。另外两个癌症发生的方面值得评论。首先，由于其在上皮-间质转化（EMT）中的已知功能，激活的NOTCH信号传导已被认为与肿瘤转移有关，包括前列腺、乳腺和结直肠癌。此外，由于NOTCH在祖细胞自我更新和分化程序中的关键作用，这些程序驱动组织发育和再生，证据表明活性NOTCH信号传导可能与癌干细胞对药物治疗的增强耐药性有关。值得进一步研究的是，NOTCH肽是否能够阻断这些以及其它对这些恶性肿瘤发展至关重要的过程，以及广泛的非肿瘤性疾病中由于NOTCH受体功能紊乱而具有因果关系的疾病，如CADASIL、Hajdu-Cheney综合征和肺动脉高压。
