本研究探讨了基于可降解金属镁（Mg）-30钙（Ca）涂层在钛（Ti）表面释放离子和升高pH值对成骨细胞样细胞成骨作用的影响。该涂层通过磁控溅射技术制备于钛基材上，先前研究表明，其在体外降解过程中可促进钛表面的碳酸钙（calcite）形成，从而增强成骨作用。然而，Mg²⁺、Ca²⁺以及pH升高在成骨过程中的独立和协同作用尚不明确。为了更全面地理解这些因素的影响，研究者制备了含有Mg²⁺和Ca²⁺盐的培养基，并通过细胞实验评估了它们对成骨细胞样细胞增殖、分化及矿化的影响。研究发现，Mg²⁺在4–5毫摩尔（mM）浓度下可显著促进早期碱性磷酸酶（ALP）活性，而不会影响增殖，但会抑制矿化。相比之下，Ca²⁺在2.3–3 mM浓度下可增强ALP活性，不影响增殖和矿化。当两种离子共存时，其对细胞增殖、ALP活性和矿化均表现出协同增强作用，表明两者共同作用可能比单独作用更具优势。此外，由Mg–30Ca涂层降解引起的pH升高在促进细胞增殖、加速ALP活性峰值以及支持矿化方面表现出更显著的效果。这些结果表明，Mg–30Ca涂层通过离子释放和pH变化两种机制促进成骨过程，为可降解金属涂层在骨再生中的应用提供了新的视角。
### 1. 引言
近年来，可降解金属材料因其在骨再生领域的应用前景而受到广泛关注。与传统的惰性材料不同，这些金属在体内逐渐溶解并释放离子，从而积极参与骨修复过程。其中，基于镁（Mg）的合金因其合适的机械性能、良好的生物相容性以及促进成骨的特性，成为极具潜力的材料之一。镁是人体必需的微量元素，参与多种细胞活动，并且其离子形式已被证明能够刺激成骨细胞的增殖、分化和矿化。此外，钙（Ca）作为一种重要的元素，也常与镁结合以进一步增强成骨潜力。然而，尽管这些材料具有良好的生物优势，它们通常不适用于牙科植入物的主体材料，因为其逐渐降解会导致结构完整性丧失，同时其机械强度通常不足以承受咀嚼时产生的高咬合力，这限制了其在承重区域的应用。
相比之下，钛（Ti）及其合金因其卓越的生物相容性而成为牙科植入物的黄金标准。首先，钛具备足够的机械强度，可以承受咀嚼时的高咬合力。其次，钛在体内表现出优异的抗腐蚀性和生物惰性，这主要归因于其表面形成的稳定的二氧化钛被动层。这种生物惰性表面有助于减少周围组织的不良反应，并允许其与骨结构直接整合，这一过程称为骨整合（osseointegration）。然而，未经处理的钛表面通常不会主动促进细胞反应，因此骨整合通常需要较长的愈合期，直到植入物与骨组织紧密结合并能够支撑修复结构。因此，钛表面的改性对于提高其成骨传导性并促进与周围骨组织的稳定、长期整合至关重要。
为了应对这一问题，研究者开发了一种基于可降解Mg–30Ca涂层的钛表面改性策略，旨在增强钛植入物的成骨传导性，同时保留其原有的机械强度和生物相容性。这种策略预计能够改善骨-植入物界面的生物反应，加快早期愈合过程，从而可能缩短整体治疗时间。本研究开发了一种Mg–30Ca涂层，该涂层在钛表面形成后具有良好的附着力，并且在生理条件下迅速溶解，随后在表面形成碳酸钙层。这一碳酸钙的形成显著促进了成骨细胞的增殖和矿化。因此，本研究证明了通过Mg–30Ca涂层的溶解来功能性改性钛表面以促进成骨的可行性。这一发现表明，Mg–30Ca涂层在应用于牙科植入物时，可能加速骨整合，使植入物更早地与颌骨结合，并有望在修复体加载前缩短愈合时间。另一方面，由于涂层中的镁和钙金属在体内迅速溶解，其周围的局部环境，如离子浓度和pH值，也会发生显著变化。然而，这些变化对细胞行为的具体影响尚未得到充分研究。尽管镁和钙离子单独已被证明支持成骨，但它们同时释放时对成骨的生物效应以及是否存在协同或拮抗作用仍不清楚。因此，本研究旨在通过模拟涂层降解后的局部环境，使用含有Mg–30Ca涂层释放离子的提取液，独立评估Mg²⁺、Ca²⁺以及pH变化对成骨细胞样细胞增殖、分化和矿化的影响，从而揭示可降解Mg–Ca涂层在牙科植入物中的应用潜力。
### 2. 材料与方法
#### 2.1 涂层制备
本研究使用磁控溅射技术，在氩气（Ar）气氛中将Mg–30Ca合金靶沉积于商业纯钛（Ti）圆盘表面。所使用的钛圆盘为纯度等级2，尺寸为10毫米×1.5毫米。Mg–30Ca涂层的钛圆盘由Maruemu Works（大阪，日本）提供。
#### 2.2 Mg–30Ca涂层的表征
涂层的厚度通过轮廓仪测定，表面粗糙度（Ra）则通过激光扫描共聚焦显微镜（VK-9710，Keyence）在×50放大倍数下测量，扫描区域约为287.1×215.6平方毫米（n=3）。扫描电子显微镜结合能谱分析（SEM/EDS；JSM-IT200LA，JEOL）用于观察涂层表面元素分布。
为了研究涂层溶解对pH的影响，Mg–30Ca涂层的钛圆盘被浸入1毫升的α型Eagle’s最低必需培养基（MEMα）中，并加入10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和0.25 µg/mL放线菌素B（FUJIFILM Wako）。随后的实验均在补充培养基中进行。钛圆盘在37°C、5% CO₂气氛下孵育，24小时后测量培养基的pH值。随后更换为新鲜培养基并再次测量pH，此过程每24小时重复一次，持续至96小时，以监测涂层溶解过程中培养基pH的变化。未处理的钛圆盘作为对照组，所有实验均重复三次（n=3）。此外，对于含有Mg²⁺、Ca²⁺以及两者共存的离子补充组，500 µL培养基在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时，并使用pH计（HORIBA）测量pH值。未添加任何离子的培养基作为对照组，所有实验均重复五次（n=5）。
#### 2.3 细胞毒性测试
本研究使用MC3T3-E1细胞（Riken BioResource Center）进行细胞毒性测试。这些细胞在37°C的湿润环境中培养，含5% CO₂。为了调节Mg²⁺浓度至5、10、50或100 mM，使用MgCl₂·6H₂O（FUJIFILM Wako）添加至细胞培养基中。未调节的培养基作为对照组（0.9 mM Mg²⁺）。为了评估细胞毒性，将约10000个细胞/mL的MC3T3-E1细胞培养在含0.9、5、10、50和100 mM Mg²⁺的培养基中，并在48孔板中进行实验。孵育1、3和5天后，使用水溶性四唑盐（CCK-8；DOJINDO）测定每组中活细胞的数量。细胞在加入10%（v/v）CCK-8试剂后，在37°C下孵育60分钟，使用微量板读数仪在450 nm波长下测量吸光度。吸光度值通过预先准备的校准曲线转换为细胞密度。随后的细胞增殖实验使用相同的协议进行。
#### 2.4 细胞存活率测试
Mg–30Ca涂层的钛圆盘在37°C下浸入培养基中孵育24小时，使涂层中的Mg²⁺和Ca²⁺释放至培养基中。释放的离子浓度通过电感耦合等离子体-原子发射光谱（ICP-AES；ICPE-9800；Shimadzu Corp.）进行定量分析。实际的细胞培养基中Mg²⁺和Ca²⁺的浓度以及Mg–30Ca涂层的提取物如表S1（支持信息）所示。基于所测得的离子浓度，将Mg–30Ca提取物组（MC30）定义为Mg²⁺浓度约为5 mM，Ca²⁺浓度为3 mM。在本研究中，如表1所示，通过向培养基中添加相应浓度的Mg和Ca盐，制备了Mg、Ca和MgCa组，以达到与MC30组相同的离子浓度。所有实验均重复五次（n=5）。
为了评估pH变化对细胞存活率的影响，MC3T3-E1细胞在不同离子组成和pH条件的培养基中进行培养。如表1所示，离子补充组的pH值为8，而pH调整组的pH值被提高至9.5。所有实验均在37°C、5% CO₂的湿润环境中进行，孵育1和5天后，使用CCK-8试剂测定每组中活细胞的数量。
#### 2.5 成骨评估
为了诱导成骨分化，使用含有10 mmol/L β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）、50 µg/mL L-抗坏血酸（L-ascorbic acid）和150 nmol/L地塞米松（dexamethasone）的培养基作为成骨诱导培养基。Mg–30Ca涂层的钛圆盘在该培养基中进行提取，并通过过滤进行灭菌，以去除培养基中形成的沉淀物。实际的细胞培养基中Mg²⁺和Ca²⁺的浓度以及Mg–30Ca涂层的提取物如表S2（支持信息）所示。基于这些数据，计算并添加相应的盐量以达到Mg²⁺和Ca²⁺的最终浓度，即约4 mM Mg²⁺和2.3 mM Ca²⁺。MC30组未添加任何Mg或Ca盐，所有离子均来源于Mg–30Ca涂层的提取。对照组使用成骨诱导培养基。所有培养基的pH值均通过pH计（HORIBA）进行分析。
为了评估成骨，使用Alizarin Red S（ARS）染色法检测矿化。在孵育21天后，使用ARS染色观察培养基中的矿化沉积。染色后的样品通过ImageJ软件（Wayne Rasband，美国国立卫生研究院）进行分析，计算染色面积。此外，为了评估pH变化对ARS染色的影响，MC3T3-E1细胞在未调整pH的成骨诱导培养基和调整至pH 9.3的培养基中进行培养。所有实验均重复三次（n=3）。
#### 2.6 统计分析
所有统计分析均通过Kaleida Graph软件版本5.0.6（Synergy Software）进行。在统计分析前，使用Smirnov–Grubbs检验评估可能的异常值。数据以均值±标准差（SD）表示，p值通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验计算。在每组实验中，p值小于0.05表示具有统计学意义，p值小于0.01则具有更高显著性。水平条表示其他组之间的显著差异。
### 3. 结果
#### 3.1 表征结果
MC30涂层的厚度为9.8微米，Mg–30Ca涂层的表面粗糙度（Ra）值为1.2微米。相比之下，未处理的钛的Ra值为1.1微米，两组之间无显著差异（图1A、B）。这些结果表明，Mg–30Ca涂层沉积在基材表面，并与基材表面形态相适应。图1C展示了未处理钛和Mg–30Ca涂层钛的扫描电镜（SEM）图像和元素分布图。EDS图谱显示，Mg和Ca元素在钛表面均匀分布。此外，Mg–30Ca涂层提取液的pH值在24小时后达到最大值（约8.3），并在96小时内逐渐下降（图S1A，支持信息）。相比之下，未处理钛（对照组）的pH值在整个观察期间保持在约7.6。Mg–30Ca提取液的pH值显著高于对照组，表明涂层溶解过程提供了持续的碱性环境。此外，仅通过离子补充的培养基中未观察到pH升高（图S1B）。
#### 3.2 Mg²⁺对MC3T3-E1细胞增殖的细胞毒性评估
图2展示了MC3T3-E1细胞在含有0.9–100 mM Mg²⁺的培养基中的增殖结果。由于原始培养基中Mg²⁺浓度约为0.9 mM，本研究未包括0 mM Mg²⁺组。对照组与10 mM Mg²⁺组之间无显著差异。然而，50 mM Mg²⁺组在3和5天后细胞密度显著降低，100 mM Mg²⁺组的细胞密度进一步下降。根据Wang等人的研究和ISO 10993–5标准，认为细胞存活率高于75%的条件为非细胞毒性。本研究的结果表明，Mg²⁺浓度在0.9–10 mM之间对细胞增殖有利（图2）。因此，后续实验采用4–5 mM Mg²⁺浓度。
在本研究的细胞增殖实验中，5 mM Mg²⁺对MC3T3-E1细胞的增殖没有显著影响。在成骨方面，Mg²⁺促进了间充质干细胞向成骨细胞的分化，并增强了包括OCN、OPN、ALP、RUNX2、IGF-1、PGC-1α和COL10A1在内的成骨标志物的表达。ALP作为成骨早期标志物，其表达在矿化初期增加。ALP染色是一种广泛用于评估间充质干细胞和成骨细胞早期成骨分化的常用方法。在本实验中，通过BCIP/NBT方法进行ALP染色，该方法涉及ALP在染色过程中对BCIP的酶促脱磷酸化。ALP活性在4天时显著增加，但在7天时未见显著差异。这表明，在成骨分化的早期阶段，Mg²⁺的浓度在4–5 mM时能有效增强ALP活性，但抑制矿化。
#### 3.3 Mg²⁺、Ca²⁺及pH对MC3T3-E1细胞存活率的影响
MC3T3-E1细胞在含有不同Mg²⁺和Ca²⁺浓度及pH值的培养基中进行培养（如表1所示）。所有组的细胞密度随培养时间增加而上升（图3A）。在1天时，各组之间无显著差异。在5天时，Mg组与对照组的细胞密度相近，Ca组与对照组也无显著差异。此外，MgCa组的细胞密度显著高于Mg组，表明Ca²⁺的加入可能对细胞增殖起到积极作用。MC30组在5天后的细胞密度显著高于其他组，这表明其较高的Mg²⁺和Ca²⁺浓度可能促进了细胞增殖。图3B展示了在1天时各组的荧光图像，显示细胞在所有组中均良好扩展。此外，细胞在5天时表现出极强的附着和增殖能力，使得单个细胞难以区分。这表明，MC30组中的高离子浓度可能促进了细胞的增殖。
为了明确pH升高对细胞增殖的独立作用，MC3T3-E1细胞在不同离子组成和pH条件的培养基中进行培养。如表1所示，离子补充组的pH值为8，而pH调整组的pH值被提高至9.5。如图S3A–C所示，仅通过离子补充的培养基中细胞增殖未见显著增强，但当pH调整至9.5时，所有离子补充组的细胞密度均显著增加。这表明，MC30组中细胞增殖的增强主要归因于pH升高。基于本研究结果，MC30组中细胞增殖的增强被认为是Mg²⁺和Ca²⁺浓度的协同作用以及pH升高的共同结果。
#### 3.4 Mg²⁺、Ca²⁺及pH对ALP活性的影响
图4A展示了各组MC3T3-E1细胞的ALP染色面积，图4B展示了对应的ALP阳性面积百分比。在4天孵育后，Mg组的ALP染色面积显著高于对照组，但在7天时未见显著差异。Ca组在4天时的ALP阳性面积百分比也显著高于对照组，但在7天时与对照组相近。MgCa组在4天时的ALP阳性面积百分比显著高于对照组和Mg组，表明Ca²⁺的加入对早期成骨分化起到了促进作用。此外，MC30组在4天时的ALP阳性面积显著高于其他组，表明其较高的离子浓度和pH值共同促进了早期成骨分化。然而，在pH调整至9.3的培养基中，MC30组的ALP活性低于对照组，这可能是因为高pH环境促进了无机磷酸盐（Pi）的积累，从而抑制了ALP活性。因此，在评估ALP活性时，MC30组的pH值被调整至8.7，以减少Pi积累对ALP活性的抑制作用。图4A、B表明，pH升高导致的Pi积累可能通过与Mg²⁺和Ca²⁺等阳离子相互作用，进一步减少Pi对ALP活性的抑制作用。
#### 3.5 Mg²⁺、Ca²⁺及pH对矿化的影响
图4C、D展示了各组MC3T3-E1细胞的ARS染色面积和定量分析结果。在21天孵育后，Mg组的ARS染色面积显著低于对照组，而Ca组的矿化水平与对照组相近。MgCa组的矿化水平略高于Mg组，但仍然低于对照组。这表明，尽管Mg²⁺和Ca²⁺的浓度与MgCa组相同，但MgCa组的矿化水平仍低于对照组。此外，仅调整pH的培养基中未观察到与对照组相同的矿化水平（图S7，支持信息）。这些结果表明，矿化需要Mg²⁺和Ca²⁺的释放以及pH升高，而单独的pH升高不足以促进矿化。因此，MC30组的矿化水平显著高于MgCa组，表明Mg–30Ca涂层的溶解提供了有利于矿化的离子环境和pH条件。此外，尽管高Mg²⁺浓度通常与矿化抑制相关，但MC30组中pH升高可能部分抵消了这一抑制作用，使矿化水平接近未处理组。
### 4. 讨论
本研究探讨了Mg–30Ca涂层降解过程中释放的Mg²⁺、Ca²⁺及pH升高对成骨细胞样细胞存活率和成骨分化的影响。为了更准确地评估这些因素的作用，研究者通过离子补充的培养基与Mg–30Ca涂层提取液进行了比较。研究发现，Mg²⁺在4–5 mM浓度下未显著抑制成骨细胞的增殖，反而在早期分化阶段增强了ALP活性。然而，这种浓度下矿化被抑制，但Ca²⁺的加入可略微改善这一情况。相比之下，Ca²⁺在2.3–3 mM浓度下未显著影响成骨细胞的增殖，反而在早期分化阶段增强了ALP活性。Mg²⁺和Ca²⁺的共同存在不仅提高了细胞增殖和ALP活性，还显著促进了矿化，表明两者之间可能存在协同作用。
此外，研究还发现，MC30组中pH升高对成骨细胞的增殖和ALP活性具有显著促进作用。尽管MC30组的初始pH值为9.5，被认为对细胞增殖过于碱性，但在孵育过程中，pH值会逐渐下降，进入更有利于细胞增殖的范围。因此，MC30组中细胞增殖的增强主要归因于其较高的pH值。然而，在单独调整pH的培养基中，ALP活性并未显著提高，这可能与高pH环境导致的Pi积累有关，从而抑制了ALP活性。因此，在评估ALP活性时，MC30组的pH值被调整至8.7，以减少Pi积累对ALP活性的抑制作用。
研究还发现，MC30组的矿化水平显著高于MgCa组，尽管两者的Mg²⁺和Ca²⁺浓度相近。这表明，MC30组中pH升高可能在矿化过程中起到了关键作用。同时，MC30组的矿化水平接近未处理组，表明其pH升高可能部分抵消了高Mg²⁺浓度对矿化的抑制作用。在一般情况下，适度的碱性环境被认为通过增强ALP基因表达和提供更有利于钙磷酸盐形成的条件，促进成骨细胞的分化。然而，在仅调整pH的培养基中，ALP活性并未显著提高，这可能是因为高pH环境下Pi的积累抑制了ALP活性。因此，MC30组的矿化水平提高可能与pH升高及Mg²⁺和Ca²⁺的协同作用有关。
本研究也存在一些局限性。首先，Mg–30Ca涂层在体内降解过程中会释放氢气，而本研究未对氢气的生成进行评估。其次，尽管本研究调整了培养基的初始pH值，但未对孵育过程中的pH变化进行实时监测，这可能影响对pH变化与细胞反应之间关系的准确评估。此外，尽管研究了Mg²⁺和Ca²⁺的协同作用，但未对它们的浓度比例进行系统优化，这可能限制了对最优离子环境的全面理解。最后，本研究未对ALP和ARS染色的定量分析进行深入研究，这可能影响对成骨分化的准确评估。未来的研究可以进一步对染色强度和钙沉积进行定量分析，以更精确地评估成骨分化并验证当前研究的发现。
### 5. 结论
本研究通过模拟Mg–Ca涂层降解后的局部环境，使用含有溶解离子和升高pH的提取液，评估了其对成骨细胞样细胞的影响。研究发现，Mg²⁺和Ca²⁺在4–5 mM和2.3–3 mM浓度下分别增强了早期ALP活性，但对增殖和矿化的影响存在差异。Mg²⁺和Ca²⁺的共同存在显著提高了细胞增殖和ALP活性，而pH升高则进一步促进了矿化。这些结果表明，Mg–Ca涂层通过离子释放和pH变化两种机制促进了成骨过程。总体而言，Mg–Ca涂层在牙科植入物中表现出良好的成骨潜力，前提是其溶解行为和局部pH变化能够被有效控制。
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