本研究揭示了Mak16这一60S核糖体组装因子中存在一个铁硫（Fe/S）簇，该簇在维持其与伴侣蛋白Rpf1形成的复合物稳定性方面起着关键作用，从而对25S核糖体RNA（rRNA）的成熟至关重要。Fe/S簇的红ox特性表明其具有较低的氧化还原电位，并且在氧气和氧化应激诱导剂存在下极易分解。这些特征提示Fe/S簇可能在核糖体组装中不仅发挥结构作用，还可能具有调控功能。这一发现不仅扩展了我们对Fe/S蛋白生物合成重要性的理解，还揭示了Fe/S辅因子在关键的真核细胞过程中的新需求。
在真核生物中，Fe/S辅因子是古老的、不可或缺的金属辅因子，参与多种核心过程，如光合作用、柠檬酸循环和呼吸作用。此外，Fe/S蛋白在DNA复制与修复、转录调控和核糖体组装等过程中发挥重要作用。例如，RNA聚合酶III和转录因子IIH均依赖Fe/S蛋白的参与，而酵母和人类细胞中的Rli1蛋白则通过其两个[4Fe-4S]簇支持核糖体回收的关键步骤。同样，人类线粒体28S和39S亚基的结构蛋白中也含有Fe/S辅因子，这些辅因子增强了亚基的稳定性并支持翻译的精确性。此外，线粒体小亚基的组装还需要[4Fe-4S]蛋白METTL17的参与。
酵母中的60S核糖体亚基组装始于核仁，通过35S rRNA的转录启动，其中包含18S、5.8S和25S rRNA。这一过程受到超过100种辅助核糖体蛋白的协调，以确保核糖体成熟过程中空间和时间的精确调控。金属离子在这一复杂过程中也扮演重要角色，对于RNA折叠、化学修饰、稳定性和组装精度至关重要。镁离子（Mg²⁺）广泛分布于核糖体中，既结合核糖核苷酸又结合蛋白质，而过渡金属如锌离子（Zn²⁺）则主要由蛋白质协调。近年来，通过冷冻电镜（cryo-EM）技术获得的多种核糖体前体结构为理解核糖体成熟过程提供了重要线索。
在核糖体成熟早期，Noc1和Noc2组装因子与Rrp5的结合构成了一个关键的共转录组装检查点。这一检查点发生在35S rRNA在内转录间隔区1（ITS1）被切割之前，导致小亚基和大亚基的分离。随后，Mak16、Rpf1、Nsa1和Rrp1组成的模块被招募，以空间上约束25S rRNA前体的结构域I和II。Mak16因其与MMS19、CIA2B和CIAO1等蛋白的共免疫沉淀现象引起了研究人员的关注，这些蛋白构成了细胞质中的Fe/S蛋白靶向复合物，负责将Fe/S簇插入到apo蛋白中。
Mak16的N端结构域（NTD）中存在一个高度保守的半胱氨酸模体，能够结合锌离子或Fe/S簇。最初，由于在大多数冷冻电镜结构中观察到Mak16要么不含金属离子，要么被假设为结合锌离子，因此认为Mak16可能是Fe/S蛋白的假设似乎并不正确。然而，由于Fe/S簇和锌离子在冷冻电镜结构中具有相似的配位环境，导致金属离子定位和识别变得困难。本研究通过体内和体外方法，对酵母和人类Mak16的生物物理特性进行了系统分析，并探讨了Fe/S簇合成缺陷对Mak16功能的影响。研究结果表明，Mak16确实含有一个真实的Fe/S簇，并且其功能依赖于Fe/S簇的合成。
为了进一步验证Fe/S簇的类型及其生物物理特性，研究团队表达了带有六组氨酸标签的人类和酵母Mak16蛋白，并在厌氧条件下进行了亲和纯化。人类Mak16在紫外线可见（UV-Vis）光谱中显示出一个特征性的肩峰，最大吸收峰位于400 nm处，且在二硫苏糖醇（DTT）还原后部分消退。这一光谱特征表明，人类Mak16不含[2Fe-2S]簇。结合铁和酸性硫化物的含量（2.6 ± 0.4和2.7 ± 1.2），以及400 nm处的实验消光系数（ε₄₀₀ nm ~ 8.5 mM⁻¹cm⁻¹），提示人类Mak16可能含有一个几乎完全占据的[3Fe-4S]¹⁺簇，或者一个部分占据的[4Fe-4S]²⁺簇。莫塞巴赫（Mössbauer）光谱分析显示，人类Mak16的Fe/S簇具有类似于所有半胱氨酸配位的[4Fe-4S]²⁺簇的参数，而电子顺磁共振（EPR）光谱则进一步确认了这一结论。此外，DTT处理后，人类Mak16的EPR信号显示出[4Fe-4S]¹⁺簇的特征。
相比之下，酵母Mak16的纯化较为困难，其Fe/S簇的稳定性较差，每个单体中含有的铁原子少于一个。然而，当与酵母Rpf1共表达时，Mak16的纯度显著提高。UV-Vis和Mössbauer光谱分析表明，酵母Mak16/Rpf1-Δ58复合物中存在[4Fe-4S]²⁺簇。值得注意的是，该Fe/S簇在有氧条件下极易分解，导致其在纯化过程中发生约50%的损失。EPR光谱进一步证实了这一点，显示在氧化条件下，复合物中存在约5%的[3Fe-4S]¹⁺簇信号。这些结果表明，酵母和人类Mak16均含有一个氧敏感的[4Fe-4S]²⁺/¹⁺簇。
研究还发现，Mak16中某些半胱氨酸残基的缺失会导致Fe/S簇的不稳定，进而影响其与Rpf1的相互作用。例如，当Cys28或Cys43被丙氨酸取代时，酵母细胞表现出严重的生长缺陷，与空载体对照相似。而Cys38的取代则表现出中间的表型，这与RNA合成效率的降低和25S rRNA水平的下降密切相关。这些结果强调了半胱氨酸残基在Fe/S簇稳定性和Mak16功能中的关键作用。同时，Mak16的Fe/S簇不仅影响其结构稳定性，还决定了其与Rpf1的功能性相互作用。
此外，研究还探讨了Fe/S簇的破坏如何影响细胞对氧化应激的敏感性。实验中发现，当细胞表达Mak16的C38A变体时，对H₂O₂、menadione和DTT等氧化应激剂的敏感性显著增加。这种现象表明，Mak16的Fe/S簇可能在氧化应激条件下释放游离的Fe²⁺，从而引发Fenton反应，生成羟基自由基（•OH），这些自由基可能对DNA和RNA造成损伤。这一机制与已知的Rli1蛋白的氧化应激敏感性相似，后者在氧化应激下也会导致Fe/S簇的破坏，进而影响其功能。这些结果进一步支持了Mak16作为Fe/S蛋白在细胞中对氧化应激具有高度敏感性的观点。
为了进一步验证Mak16的Fe/S簇对核糖体成熟过程的重要性，研究团队还评估了Fe/S簇合成缺陷对rRNA水平的影响。当酵母细胞中缺乏Nfs1、Cia2和Nar1等Fe/S合成相关因子时，总rRNA水平显著下降，尤其是25S rRNA的减少最为明显。这些结果表明，Fe/S簇的破坏会显著影响Mak16的功能，进而导致核糖体生物合成的障碍。同时，Mak16与Rpf1的相互作用也受到Fe/S簇稳定性的影响，当Fe/S簇受损时，Mak16与Rpf1的结合能力下降，进一步加剧了核糖体成熟过程的缺陷。
本研究还揭示了Mak16在不同物种中的功能差异。尽管Mak16在不同进化距离的物种中均含有Fe/S簇，但其功能整合到核糖体生物合成中依赖于与特定组装因子的精确相互作用。例如，酵母Mak16的C端区域缺乏酸性结构域，而人类Mak16则含有该结构域。这种结构差异可能解释了为什么在某些物种中Mak16的Fe/S簇稳定性较低。此外，研究还发现，Mak16的C端含有色氨酸（Trp）残基，这在某些寄生虫中更为常见。这一发现提示，不同物种的Mak16可能在Fe/S簇的合成和功能调控上存在差异。
在核糖体成熟过程中，Fe/S簇的稳定性至关重要。当Fe/S簇被破坏时，不仅会影响Mak16的结构，还可能干扰其与Rpf1的相互作用，从而影响核糖体的组装效率。同时，Fe/S簇的破坏还可能导致细胞对氧化应激的敏感性增加，这可能是由于Fe/S簇分解后释放的Fe²⁺在氧化环境中引发的自由基反应。这种现象与已知的其他Fe/S蛋白（如Rli1和METTL17）在氧化应激下的行为类似，表明Fe/S簇在核糖体生物合成过程中可能具有双重功能：既作为结构稳定剂，又作为氧化应激的传感器，从而调节细胞内的氧化还原平衡。
综上所述，本研究揭示了Mak16在核糖体生物合成中的关键作用，以及其Fe/S簇在维持核糖体结构稳定性和调控氧化应激反应中的重要性。Mak16作为Fe/S蛋白，其功能依赖于复杂的生物合成途径，如线粒体的 ISC（铁硫簇合成）和细胞质的 CIA（细胞质铁硫蛋白组装）机制。这些机制不仅对Mak16的成熟至关重要，还对其与Rpf1的相互作用和核糖体组装效率产生深远影响。研究结果表明，Fe/S簇的破坏会导致Mak16的结构不稳定，进而影响核糖体的成熟过程，降低细胞的生存能力。这一发现不仅扩展了我们对Fe/S蛋白在真核细胞中功能的认识，还强调了Fe/S簇生物合成在核糖体成熟中的关键作用。
