西伯利亚东北部野鸭中两种新型小核糖核酸病毒的宏基因组鉴定、分离与全基因组表征研究

本刊推荐研究人员针对家鸭养殖中鸭甲肝病毒(DHAV)带来的重大负担问题，开展了对西伯利亚东北部野鸭源新型小核糖核酸病毒的鉴定与特性研究。通过宏基因组测序技术，团队成功分离出两株病毒：一株为与DHAV-1型高度分化（核苷酸一致性77.83%）的鸭甲肝病毒新谱系，另一株为与短喙侏儒综合征相关病毒相似度仅60.16%的新型鸭小核糖核酸病毒(DPiV)。研究证实病毒可在鸭胚和原代鸭胚成纤维细胞(DEF)中有效复制，并首次揭示了其基因组结构、抗原表位差异及潜在重组事件，为野生水禽病毒库的监测和家禽疫病防控提供了关键数据。

在欧亚大陆的家鸭养殖场中，鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV）引起的病毒性肝炎一直是一项严峻挑战。这种属于禽肝炎病毒属（Avihepatovirus）的病原体可导致雏鸭急性肝炎、胰腺病变甚至死亡，对畜牧业经济造成显著损失。目前已知DHAV存在三种基因型（DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3），但其在野生鸟类中的多样性及潜在传播风险仍未被充分认知。西伯利亚东北部作为众多候鸟的繁殖地，是研究野生动物病毒库的理想区域，然而该地区鸭源病毒的遗传特征和生物学特性长期缺乏系统研究。

为解决这一问题，研究人员在《Virology Journal》发表的最新研究中，对来自西伯利亚雅库特地区的绿翅鸭（Anas crecca）粪便样本进行宏基因组测序，成功鉴定并分离出两种新型小核糖核酸病毒：一株为高度分化的DHAV（命名为DHAV/18Yak），另一株为与已知病毒差异显著的新型鸭小核糖核酸病毒（DPiV/18Yak）。研究通过鸭胚接种和原代细胞培养获得病毒纯分离株，结合3'-末端快速扩增（3'-RACE）、全基因组测序和生物信息学分析，首次揭示了这两株病毒的完整基因组结构、进化地位及潜在生物学特性。

关键技术方法概述

研究团队采用改良的NetoVir流程富集病毒样颗粒，通过宏基因组测序（GenoLab M平台）组装病毒序列，并经RT-PCR验证病毒存在。利用鸭胚接种和鸭胚成纤维细胞（DEF）培养进行病毒分离，通过胚胎致死剂量（ELD₅₀）实验评估病原性。基因组注释依托VADR工具和手动比对，系统发育分析采用最大似然法（IQ-TREE2），同时使用RDP5软件检测重组事件，并通过RNAfold预测IRES二级结构。

研究结果

3.1. 宏基因组检测发现小核糖核酸病毒

对三只绿翅鸭粪便样本的测序生成约1,960万条读长，其中13.9万条读长被注释为小核糖核酸病毒科。覆盖率最高的两条contig分别被鉴定为Avihepatovirus ahepati物种的DHAV（覆盖率268×）和未分类的DPiV（覆盖率235×）。RT-PCR证实两种病毒均来源于同一粪便样本（编号18Yak）。

3.2. DHAV与DPiV的分离

病毒接种12日龄鸭胚后，从尿囊液中成功分离出DHAV/18Yak和DPiV/18Yak。尽管在DEF细胞中未观察到明显细胞病变效应（CPE），但通过RT-PCR检测到病毒复制。DHAV/18Yak在鸭胚中表现出致病性，其ELD₅₀为10^1.55 ELD₅₀/mL。

3.3. 遗传特征分析

DHAV/18Yak基因组全长7,731 nt，其多聚蛋白核苷酸序列与DHAV-1参考株（DQ219396）一致性仅为77.83%。结构蛋白编码区（P1）与DHAV-2型相似度更高（VP1氨基酸一致性达88.66%），而非结构蛋白（如2A3、2B）与DHAV-1完全一致。抗原表位分析显示，VP1的⁷⁵GELVVT⁸²区域和VP3的²⁰⁵PTTI²⁰⁸区域与已知DHAV表位存在差异，提示潜在抗原分化。Simplot和重组检测表明P1区可能与DHAV-2发生重组。

DPiV/18Yak基因组全长7,431 nt，其多聚蛋白与参考株（MT681985）氨基酸一致性仅61.89%。系统发育分析显示该病毒位于未分类禽小核糖核酸病毒支系的基部，其P1蛋白一致性（51.33%）低于ICTV新属划分阈值，但2C、3C、3D蛋白一致性未达标准，因此暂被归为未分类物种。

结论与意义

本研究首次在西伯利亚野生鸭类中发现并分离出两种新型小核糖核酸病毒，其中DHAV/18Yak可能代表DHAV-1型的一个新基因型，而DPiV/18Yak则可能属于新的病毒属。病毒在鸭胚中的复制能力及基因组中的抗原差异提示其潜在跨物种传播风险。研究结果不仅拓展了对禽类小核糖核酸病毒多样性的认知，也为监测野生鸟类病毒库、预警家禽新发传染病提供了重要依据。后续需通过电子显微镜、深度测序及动物实验进一步验证病毒纯度和生物学特性。