基于SHERLOCK技术的快速精液鉴定系统的构建与验证

法医现场快速检测精子特异性mRNA的新方法，基于CRISPR/Cas13a系统与快速核酸释放试剂联用，灵敏度达0.25μL，显著缩短检测时间并降低仪器依赖。

余罗 | 王贤苗 | 范阳 | 赵一霞 | 胡胜 | 刘淑瑜 | 李双 | 罗国昌 | 孙启帆

青海省大学医学院基础医学科学系，西宁 810016，青海

摘要

本研究基于CRISPR/Cas13a系统开发了一种用于检测精液特异性mRNA的快速检测方法，以满足法医现场体液识别的时效性要求。设计并筛选了针对精液特异性mRNA基因的特异性引物和CRISPR RNA（crRNA）短片段，建立了基于CRISPR/Cas技术的SHERLOCK检测方法。此外，还筛选了用于处理样本的核酸快速释放剂，以构建结合SHERLOCK的新检测方法，并对其特异性和灵敏度进行了测试。该方法能够快速检测未知体液样本中是否存在精液，精液样本的相对荧光单位（RFU）值显著高于非精液样本（P < 0.0001），样本检测灵敏度可低至0.25 μL。通过快速提取和SHERLOCK相结合的方法构建了这种快速精液检测技术，减少了操作时间，显著降低了仪器依赖性，为法医现场快速体液识别提供了创新解决方案。

部分内容

样本采集与制备

在获得知情同意后，根据公安部鉴定中心科学研究伦理委员会批准的方案（批准编号：2023-002），收集了外周血、精液、唾液、月经血和阴道分泌物样本。具体采集程序如下：外周血通过肘正中静脉穿刺采集；精液在性行为后使用无菌塑料杯收集。

RPA引物和crRNA的筛选与验证

使用筛选出的RPA引物进行反应后，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段的大小与目标片段一致。使用SHERLOCK方法检测了三个精液样本和阴性对照样本。结果显示，精液中SEMG1和PRM1标记物的平均RFU值分别为4.33×10⁵和3.29×10⁵，与阴性对照样本形成明显对比（图1）。

讨论

法医体液污渍的快速准确鉴定是犯罪现场调查的关键步骤[17]。尽管传统的实验室RT-PCR-CE方法在精液鉴定方面具有高度特异性[18]、[19]、[20]、[21]、[22]，但由于它们依赖于复杂的核酸提取程序和大型仪器（如毛细管电泳系统），限制了其在现场快速检测中的应用[23]、[24]。

据我们所知，这是首次使用CRISPR-Cas13a技术进行此类研究的报道。

资助

本研究得到了青海省大学医学院青年和中年教师科研基金（2023-kyy-4）、国家重点研发计划（2022YFC3341002）以及公安部加强警察科技基础工作计划的支持（2022JC11）。

作者贡献声明

孙启帆：指导。 王贤苗：撰写 – 审稿与编辑。 余罗：撰写 – 初稿。 罗国昌：指导。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。