克鲁兹锥虫（Trypanosoma cruzi）中metacaspase-3的钙依赖性及其生化特性研究

时间：2025年12月24日

来源：Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics

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Trypanosoma cruzi的metacaspase TcMCA3的钙依赖性激活机制、自加工特性及酶动力学研究，发现其活性受钙浓度（1-25 mM）、pH（8.5）和离子强度调控，并揭示结构重组对功能的关键作用，为抗锥虫病治疗提供新靶点。

莫吉达斯克鲁塞斯大学生物化学研究跨学科中心，Av Dr. Cândido Xavier de Almeida e Souza, 200, 08780-991 莫吉达斯克鲁塞斯，巴西

摘要

Metacaspases是一类结构上与caspases相关的半胱氨酸蛋白酶，在植物、真菌和原生动物中广泛存在，但在后生动物中不存在。在导致查加斯病的病原体Trypanosoma cruzi中，metacaspases的功能和生化特性仍知之甚少。在本研究中，我们对metacaspase TcMCA3进行了详细的表征，重点研究了其表达、纯化、钙依赖性加工及其酶活性。SDS-PAGE和Western blot分析显示，TcMCA3主要以加工形式存在，并在钙存在下发生进一步的自切割。动力学分析表明，钙可以激活TcMCA3，使其催化效率（k_cat/K_M）和周转率（k_cat）在1 mM CaCl₂浓度下提高，超过该浓度后活性会下降，可能是由于自降解。最佳活性出现在pH 8.5和25 mM NaCl条件下，这表明该酶需要微碱性和中等离子强度的环境。荧光光谱学证实，TcMCA3在钙结合时会发生构象变化，存在一个高亲和力的结合位点负责其结构激活。我们观察到，钙依赖性加工与催化活性的变化相关，表明TcMCA3的不同亚型之间存在结构和功能差异。总体而言，我们的发现表明TcMCA3的激活受到钙、pH值和离子强度的严格调控，而钙结合诱导的结构重排对其酶功能至关重要。这些发现有助于我们更好地理解原生动物寄生虫中metacaspases的调控机制，并可能为未来将TcMCA3作为治疗T. cruzi的潜在靶点提供依据。

引言

Metacaspases属于半胱氨酸蛋白酶的CD家族，与caspases具有远缘结构同源性，但在底物特异性和调控机制上存在差异[1]。这类蛋白酶在植物、真菌和原生动物中广泛存在，但在后生动物中几乎不存在[2]。在Saccharomyces cerevisiae中，已鉴定出一种名为YCA1的metacaspase，它参与多种类型的应激诱导的细胞死亡，包括氧化应激、渗透压失衡、病毒感染和衰老过程[3,4]。除了在应激反应中的作用外，YCA1还参与细胞周期调控[5]和蛋白质聚集物的清除[6]。

在像Trypanosoma cruzi这样的原生动物寄生虫中，metacaspases由多基因家族编码，其精确的生物学功能尚未完全阐明[7]；在T. cruzi中，至少有五个基因被归类为I型metacaspases，因为它们具有N端pro结构域[8]，其中metacaspase-3（TcMCA3）被认为与寄生虫的分化和存活密切相关，尤其是在响应钙信号时，这对宿主入侵和细胞内信号传导至关重要[9]；相比之下，像Trypanosoma brucei这样的寄生虫编码多个metacaspase亚型，已鉴定出五个亚型（TbMCA1–5），其中至少有三个对血液型寄生虫的存活至关重要[10]。在这些亚型中，TbMCA4虽然不具备催化活性，但对寄生虫的增殖和毒力至关重要，其成熟依赖于活性metacaspase TbMCA3的蛋白酶加工[11,12]。

为了研究蛋白酶加工对metacaspase活性的影响，Moss等人培育了一种对Ca2+依赖性自加工具有抗性的TbMCA2突变体（MCA^2K55,268G），证明该突变体在Ca²⁺存在下仍保持完整的蛋白酶活性[14]。Gilio等人也发现，经过加工的TbMCA2能够有效水解大分子底物（如偶氮酪蛋白），而非加工形式的TbMCA2在相同条件下无法降解偶氮酪蛋白[15]。在较高温度下，TbMCA2的自加工更为显著，表明轻微的加工不会对其活性产生不利影响，但过度切割会导致酶活性丧失[16]。不同物种间metacaspase的成熟过程存在差异：例如，II型植物metacaspases通过p20–p10结构域间的切割实现自催化激活[14]，而在Leishmania major中，metacaspase LmjMCA在异源酵母表达系统中也能发生自加工，这种现象在催化失活的突变体中不存在，说明酶活性是必需的[7,17]。

迄今为止，关于T. cruzi metacaspases（包括TcMCA3）的体外和体内自加工机制的研究还不够充分[7]。尽管在体外条件下容易观察到TbMCA2的自蛋白酶降解，但在正常培养条件下尚未在寄生虫细胞中检测到这一现象，这可能是由于细胞质内钙水平受到严格调控，只有在对特定刺激或应激因素的反应下才会升高。

在本研究中，我们重点研究了来自T. cruzi的metacaspase TcMCA3的生化和结构特性。我们通过荧光光谱学方法探讨了其钙依赖性激活机制和最佳酶活性条件以及结构变化。我们的结果揭示了TcMCA3的关键调控特性，支持了将metacaspases作为原生动物寄生虫潜在治疗靶点的观点。

TcMCA3的克隆

我们从ENA数据库（登录号DQ015871）获取了Trypanosoma cruzi metacaspase-3基因（TcMCA3）的全长序列，并由Thermo Fisher Scientific公司合成。该基因被克隆到pMA-RQ载体（Thermofisher）中，其序列通过DNA测序进行了验证。

设计了特异性引物通过PCR扩增TcMCA3基因和pET28(a) +载体。PCR条件经过优化，退火温度为62°C。扩增产物被克隆到相应的载体中。

TcMCA3主要以加工形式存在

重组TcMCA3的SDS-PAGE分析（图1A）证实了纯化过程的效率，显示主要有一条约31 kDa的条带，对应于经过加工的酶亚型。全长约41 kDa的条带缺失或强度较低，表明TcMCA3主要以加工形式存在，这与之前对T. brucei中同源物TbMCA2的研究结果一致[13,16]。

“酶加工”一词表示蛋白质被特定的酶切割。

结论

本文对Trypanosoma cruzi中的metacaspase TcMCA3进行了全面的生化表征，揭示了其激活机制和调控特性的关键方面。我们的研究表明，在实验条件下，TcMCA3主要以加工形式存在，钙能促进/加速其自蛋白酶降解过程。该酶在特定钙浓度范围内表现出最佳活性，超过该浓度后催化效率会下降。

作者贡献

ACMD、JPMSC和MNRT负责TcMCA3的克隆、表达和纯化。

ACMD、WASJ和VHO负责动力学实验。

MFMM负责实验方案的设计和手稿的撰写。

CRediT作者贡献声明

Ane Caroline Moreira Duarte： 资源提供、方法学设计、实验实施。

Vinicius Henrique de Oliveira： 资源提供、方法学设计、实验实施。 João Pedro Martins Silva Costa： 资源提供、方法学设计、实验实施。 Mariana Nascimento Romero Trujilho： 资源提供、方法学设计、实验实施。 Wagner Alves de Souza Judice： 初稿撰写、资源提供、方法学设计、实验实施、结果验证、监督。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了FAPESP的资助（项目编号2022/06394-0，资助对象为MFMM）和FAPESP的资助（项目编号2021/01503-2，资助对象为WASJ）。ACMD、JPMSC和MNRT还获得了CAPES的奖学金支持。