缺氧损害人回肠来源类器官的生长
为了探究低氧水平对肠道干细胞（ISC）增殖的影响，研究人员在常氧（20% O2）和低氧（1% O2）条件下培养人回肠来源的类器官。实验证实，低氧条件下，类器官对缺氧产生了响应，表现为HIF-1α蛋白的稳定以及缺氧反应基因（如CA9、VEGF和GLUT1）的表达上调。然而，与常氧条件相比，低氧培养显著损害了类器官的生长，表现为类器官数量减少和体积缩小。这种生长抑制效应与低氧暴露时间呈正相关，并且在不同的患者供体来源的类器官中均得到验证，表明低氧对人回肠来源的类器官生长具有普遍的抑制作用。
干性与缺氧在回肠来源类器官中呈负相关
为了从分子机制层面理解低氧如何损害类器官生长，研究人员对常氧和低氧培养的类器官进行了转录组分析。结果显示，低氧条件下，Wnt信号通路活性被抑制，而Wnt信号对于维持干性至关重要。差异表达基因分析进一步揭示，多个干细胞相关基因（如HOPX、AXIN2、LGR5、OLFM4等）的表达在低氧条件下显著下调。相关性分析表明，干性与缺氧呈负相关。通过细胞类型反卷积分析预测，低氧培养的类器官中干细胞比例减少。值得注意的是，即使定期补充Wnt因子，也无法挽救低氧导致的类器官生长抑制，这提示低氧对干性的抑制是独立于Wnt因子补充的。
低氧诱导人回肠来源类器官中干细胞的丢失
为了直接验证低氧是否改变了类器官的细胞组成并减少了干细胞数量，研究人员进行了单细胞RNA测序。分析结果显示，来自三个不同供体的类器官在低氧条件下均表现出干细胞比例的显著降低。通过CytoTRACE评估单细胞水平的干性潜能，也证实了低氧条件下干性评分的降低。这些发现从单细胞层面证实了低氧导致了干细胞的丢失。qRT-PCR实验进一步验证了低氧条件下干细胞相关基因（OLFM4、LGR5、AXIN2）的表达下调。流式细胞术分析显示，低氧条件下Ki-67阳性的增殖细胞比例显著减少。此外，无论是在持续补充Wnt因子的高Wnt培养基中，还是在诱导分化的低Wnt培养基中，低氧均能下调OLFM4的表达，且这种效应并非由细胞毒性引起。这些结果共同证实，低氧通过减少干细胞数量来损害人回肠来源类器官的生长。
人回肠来源类器官的形成效率随低氧暴露时间延长而降低
为了从功能上验证低氧对增殖/干细胞能力的损害，研究人员评估了低氧暴露后类器官形成新类器官的能力。实验发现，类器官形成新类器官的数量与低氧暴露时间成反比，即低氧暴露时间越长，类器官形成效率越低。这一功能学实验证实了低氧暴露会逐渐损害ISC的增殖和形成新类器官的能力。鉴于ISC功能依赖于线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），而OXPHOS需要氧气作为线粒体呼吸链的最终电子受体，研究人员推测低氧可能通过抑制OXPHOS来直接损害干细胞功能。实验结果显示，使用线粒体复合物III抑制剂antimycin A处理类器官，能够模拟低氧效应，显著降低OLFM4基因的表达。这表明ISC对低氧条件敏感，因为低氧抑制了OXPHOS，而OXPHOS是干细胞功能的基础。
HIF-1α活性在常氧条件下降低干细胞活性
在低氧条件下，HIF-1α/β作为转录因子，驱动许多HIF靶基因的转录。为了评估HIF-1α活性是否在低氧诱导的干性降低中起关键作用，研究人员在常氧条件下使用PHD抑制剂roxadustat和CoCl2来稳定HIF-1α。实验证实，这些处理能够稳定HIF-1α蛋白并上调HIF-1α靶基因CA9的表达。重要的是，在常氧条件下稳定HIF-1α，能够显著降低干细胞相关基因OLFM4的表达，其程度与低氧条件下的效应相当。成像分析显示，在常氧条件下稳定HIF-1α会导致类器官数量减少，表明类器官生长受损。为了功能性地验证HIF-1α稳定对ISC生成新类器官能力的影响，研究人员进行了传代实验。结果显示，与溶剂对照相比，roxadustat处理的类器官形成新类器官的效率显著降低。这一功能学评估表明，通过PHD抑制化学稳定HIF-1α，能够重现低氧条件下观察到的干性缺陷，从而支持HIF-1α是连接氧气可用性与ISC功能的关键机制。
