引言
在哺乳动物细胞培养中，为防止细菌污染，培养基中常规添加抗生素（如青霉素/链霉素，PenStrep）已成为普遍做法。然而，抗生素的长期使用可能对下游实验结果产生难以察觉的干扰。尽管基因组学和转录组学研究已报道了抗生素处理与非处理细胞之间的差异，但在蛋白质组层面进行全面比较的研究尚属缺乏。本研究旨在系统揭示HepG2细胞在含抗生素（PenStrep）与不含抗生素培养基中培养时，全蛋白质组范围内的动态变化。
方法
细胞培养与实验设计
HepG2细胞在含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基中培养。实验采用纵向交叉设计：细胞先在抗生素（A）或无抗生素（N）培养基中平行培养5个代次（passage），随后在第6代进行交叉处理，形成四个条件组：持续抗生素（A1–9）、持续无抗生素（N1–9）、从无抗生素转为抗生素（N5A1–4）以及从抗生素转为无抗生素（A5N1–4）。每个代次细胞在达到约80%融合度时收获，共获得119个样品。
样品制备与质谱分析
细胞裂解液采用自动化单罐固相增强样品制备（SP3）方法进行处理，然后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合数据非依赖采集（DIA）模式进行分析。使用DIA-NN软件进行蛋白质定量，以人类参考蛋白质组数据库进行鉴定。
数据分析
数据经过缺失值插补、对数转换和总蛋白量归一化后，采用线性混合效应模型（LME）进行统计分析，以评估处理条件（固定效应）和代次（随机效应）对蛋白质丰度的影响。差异丰度蛋白的判定标准为Benjamini-Hochberg校正后p值≤0.01。同时进行基因本体（GO）富集分析以揭示受影响的关键生物学通路。
结果与讨论
实验设计与蛋白质定量概况
该交叉实验设计能够同时观察长期处理（9个代次）以及处理转换（引入或撤除抗生素）引起的蛋白质组动态变化。平均每个样品检测到约9,210种蛋白质，总计鉴定到10,255种蛋白质，其中7,606种蛋白质在所有样品中均被检测到，表明数据具有高度一致性和可靠性。
线性混合效应模型揭示处理与代次效应
模型比较显示，以处理条件为固定效应、代次为随机截距的线性混合效应模型（FC_RI）最适合本数据集。分析表明，抗生素处理引起的蛋白质组变化在处理转换后的第一代最为显著，随后逐渐稳定，约三代后达到新的稳态。从无抗生素环境转为抗生素环境（N→A）所引发的差异蛋白数量，多于从抗生素环境转为无抗生素环境（A→N），提示引入抗生素可能引发更强烈的细胞应激反应。
差异丰度蛋白与核心通路
在严格阈值下，共鉴定出139个差异丰度蛋白。其中，14个蛋白在多个比较中表现一致。例如，糖乙酰转移酶（GCAT）在抗生素存在下持续上调，该酶参与甘氨酸代谢，可能与氧化应激保护机制相关。相反，甲硫氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）在抗生素存在下下调，影响S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成和甲基化过程。其他显著变化的蛋白包括参与脂肪酸β-氧化的肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A，抗生素下上调）、内质网伴侣蛋白蛋白二硫键异构酶A2（PDIA2，抗生素下调）以及多种与膜结构、细胞信号和癌症相关的蛋白（如CAVIN2、STEAP3、MTUS1、MTDH、FAM3C）。
通路富集分析
GO富集分析显示，抗生素处理主要影响了以下几个方面的通路：
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核糖体生物发生与RNA处理：在无抗生素条件下富集，提示抗生素可能抑制真核细胞核糖体的生成与功能。
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线粒体与代谢通路：包括脂质代谢（如脂肪酸氧化、de novo脂质合成）、碳水化合物代谢和氧化磷酸化相关通路发生显著改变。
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应激反应与蛋白稳态：抗生素条件下，未折叠蛋白反应（UPR）、p53通路、铁死亡（ferroptosis）等应激相关通路被激活，同时涉及分子伴侣（如HSP蛋白）和泛素-蛋白酶体系统的蛋白发生改变。
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跨膜转运：多种溶质载体（SLC）家族蛋白差异表达，影响营养物质和代谢物的细胞转运。
与已有研究的比较
将本研究结果与Ryu等人的转录组研究对比，发现仅有14个基因/蛋白在差异表达上完全一致，凸显了转录组与蛋白质组层面响应抗生素的差异性。然而，在通路层面，本研究与多项利用不同细胞系和抗生素（如庆大霉素、两性霉素B）的研究存在共性发现，均指向抗生素对线粒体功能、氧化应激、脂质代谢、蛋白周转和细胞骨架的保守性影响。例如，脂质代谢通路的重编程是一个突出且一致的发现，涉及脂肪酸的摄取、合成、氧化、储存和转运等多个环节的蛋白（如ACSL3、CPT1A、PLIN2、FABP1、MTTP等）发生改变，可能源于抗生素对线粒体和内质网功能的间接干扰。
结论
本研究通过深入的蛋白质组学分析证实，在HepG2细胞培养中使用青霉素-链霉素会显著重塑细胞蛋白质组，影响核心的代谢和核糖体程序。这些脱靶效应具有时间动态性，并在处理转换初期最为明显。研究结果强调，在基于体外细胞的蛋白质组学研究中，抗生素的使用是一个不可忽视的混淆变量。建议在研究设计中明确抗生素的使用情况，并在比较不同处理或整合跨研究数据时充分考虑其潜在影响。对于需要精确评估代谢、氧化应激或蛋白合成等相关通路的实验，尤其应审慎决定是否使用抗生素。未来研究可拓展至更多细胞系和抗生素类型，并探索使用抗氧化剂（如N-乙酰-L-半胱氨酸，NAC）等策略来 mitigating 抗生素的脱靶效应。
