实验设计与技术优化
本研究旨在深入解析巨噬细胞在早期免疫应答中S-棕榈酰化的动态变化。S-棕榈酰化是一种可逆的脂质修饰，通过将16碳脂肪酸棕榈酸共价连接到半胱氨酸残基上，调控蛋白质的膜定位、稳定性及相互作用。然而，其在巨噬细胞快速重编程中的全面作用尚不完全清楚。
为克服传统蛋白质组学在鉴定棕榈酰化蛋白时的技术瓶颈，研究团队采用了优化的酰基-生物素交换（ABE）技术。该技术首先通过三(2-羧乙基)膦（TCEP）还原潜在的二硫键，随后使用N-乙基马来酰亚胺（NEM）封闭所有游离巯基。接着，利用羟胺（HA）特异性裂解硫酯键，并同时将新暴露的巯基进行生物素化标记。最后，通过链霉亲和素珠富集生物素化蛋白，进行后续分析。
研究的一个关键创新在于采用了多酶切策略。除了常规的胰蛋白酶（Trypsin）外，还平行使用了天冬氨酸内切酶（AspN）、糜蛋白酶（Chymotrypsin）和谷氨酸内切酶（GluC）进行消化。通过分析允许的漏切位点数，研究确定允许3个漏切位点足以覆盖超过95%的肽段，从而显著提高了对疏水性膜蛋白的鉴定覆盖率。
巨噬细胞模型的建立与刺激
研究选用了永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDMs）作为模型，该细胞系能更好地模拟原代巨噬细胞的生理特性。细胞经100 ng/mL的脂多糖（LPS）刺激30分钟，以捕捉早期信号事件。为验证实验特异性，研究设置了严格的对照，包括使用不含羟胺的缓冲液处理样本，以排除非特异性结合。
蛋白质组学数据采集与分析
富集后的蛋白经不同蛋白酶消化后，分别使用Thermo Orbitrap Q-Exactive HF和Thermo Orbitrap Fusion Eclipse质谱仪进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。原始数据使用MaxQuant软件（2.4.14.0）进行处理，搜索UniProt小鼠参考蛋白质组数据库。为鉴定棕榈酰化候选蛋白，研究比较了羟胺处理组（HA+）与对照组（HA-）的标记自由定量（LFQ）强度。蛋白质被认定为棕榈酰化候选物需满足以下标准：错误发现率（FDR）< 0.05，且Log2倍数变化（FC）> 2。
全局蛋白质组稳定性验证
为确保观察到的变化主要反映棕榈酰化状态的改变而非总蛋白表达量的波动，研究首先比较了未处理组和LPS刺激组的总蛋白质组。结果显示，两组间的Log2LFQ强度呈高度线性相关（皮尔逊相关系数r = 0.995），表明30分钟的LPS刺激并未引起整体蛋白质丰度的显著变化。这证实了后续在ABE富集组分中观察到的差异确实源于棕榈酰化修饰的动态调控。
巨噬细胞棕榈酰化蛋白质组的深度解析
通过多酶切ABE蛋白质组学策略，研究在巨噬细胞中鉴定到2502个高置信度的S-棕榈酰化候选蛋白。为评估数据集的创新性，研究将其与小鼠免疫SwissPalm数据库进行了比较。结果显示，有1378个蛋白是首次在免疫细胞背景下被鉴定为棕榈酰化候选物，极大地扩展了已知的巨噬细胞棕榈酰化蛋白质组。
多酶切策略被证明是发现新候选物的关键。在1378个新发现的蛋白中，有556个是仅通过非胰蛋白酶（AspN、糜蛋白酶或GluC）鉴定到的，凸显了互补酶切策略在克服胰蛋白酶消化局限性方面的重要性。
新候选物的功能特征与验证
对1378个新候选蛋白进行功能富集分析发现，它们显著富集于RNA加工、非编码RNA代谢过程及核糖核蛋白复合物生物发生等生物学过程。在细胞组分上，这些蛋白主要定位于核糖核蛋白复合物、细胞内细胞器腔及核蛋白复合物。此外，UniProt注释关键词分析显示，磷酸化蛋白和乙酰化是这些新候选物最显著的特征，提示棕榈酰化与这些翻译后修饰之间存在广泛的相互作用。
为验证质谱鉴定结果的可靠性，研究选取了两个新发现的候选蛋白进行验证：CPSF6（通过GluC酶切鉴定）和GYG1（通过GluC、AspN和糜蛋白酶切鉴定）。通过ABE结合Western Blotting，研究成功证实了内源性CPSF6和GYG1在iBMDMs中确实发生S-棕榈酰化，从而验证了大规模质谱鉴定的准确性。
LPS刺激下棕榈酰化蛋白质组的动态重塑
研究进一步探究了LPS刺激30分钟内棕榈酰化蛋白质组的动态变化。整合所有蛋白酶的数据分析显示，共有648个蛋白表现出条件特异性的富集。其中，308个蛋白主要富集于未处理细胞中，而340个蛋白主要富集于LPS处理细胞中。这表明在LPS刺激的早期阶段，巨噬细胞的棕榈酰化蛋白质组发生了快速且广泛的重塑。
动态调控蛋白的功能注释
为理解这种快速重塑的生物学意义，研究对648个动态调控蛋白进行了功能富集分析。
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未处理细胞富集蛋白（308个）：这些蛋白的功能主要富集于核糖体生物发生、RNA加工及谷胱甘肽代谢等基础细胞维持和稳态过程。此外，表型分析还显示出与胚胎致死性和产前致死性相关的富集，提示这些蛋白的组成型棕榈酰化对于维持巨噬细胞的基本生理功能和存活至关重要。
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LPS处理细胞富集蛋白（340个）：与未处理组形成鲜明对比，LPS处理后富集的蛋白显著富集于免疫系统过程、免疫应答调控信号通路等。通路分析进一步揭示，这些蛋白涉及流感、结核病、耶尔森菌病及HIV等多种感染相关通路，表明LPS可能通过调控棕榈酰化来激活广泛的抗病原体机制。此外，C型凝集素受体、Fc epsilon RI及T细胞受体信号通路等特异性信号模块也显著富集。在该组中，研究还检测到了多个关键免疫调节因子的动态棕榈酰化，如MyD88、Map2k3、IRF9和MARCKS，提示它们的棕榈酰化可能促进其向膜微结构域的快速募集，从而协调炎症反应。
讨论与展望
本研究通过多酶切ABE蛋白质组学策略，绘制了巨噬细胞S-棕榈酰化蛋白质组的深度图谱，并揭示了其在LPS早期刺激下的快速动态重塑。功能分析表明，LPS诱导的棕榈酰化主要靶向免疫信号和感染应答相关蛋白，而基础状态下的棕榈酰化则更倾向于维持细胞基本功能。这些发现不仅为理解巨噬细胞生物学和先天免疫调控提供了宝贵的资源，也为未来研究棕榈酰化在免疫相关疾病中的作用机制指明了方向。
