Abstract
胶质母细胞瘤（GBM）因其显著的瘤内异质性和血脑屏障（BBB）的存在，构成了持续的治疗挑战。核酸适配体作为一种有效的替代方案，有望克服这些传统疗法往往难以逾越的生理障碍。本综述概述了适配体从基础配体到功能化治疗剂的演进过程，重点关注其靶向胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）和设计跨越血脑屏障的工程化机制。我们讨论了最近的生物技术发展，包括细胞-SELEX（Cell-SELEX）和人工智能（AI）辅助设计，如何解决早期与体内（in vivo）稳定性和构象选择性相关的问题。此外，文章评估了向多功能系统的转变，例如设计用于受体介导转运的适配体-药物偶联物（ApDC）和“药物适配体”。这些进展表明，下一代适配体平台可能克服当前的转化局限，实现更精确的神经肿瘤治疗。
Introduction
适配体是短的单链DNA（ssDNA）或RNA分子，通常由20-100个核苷酸组成。它们通过折叠成特定的三维构象来获得功能，从而能够以高亲和力和特异性结合多种特定靶分子。其概念源于20世纪90年代初，SELEX技术的建立为适配体的开发奠定了基础。适配体主要通过表面识别和三维相互作用（如范德华力、疏水作用和静电作用）与靶标结合。
为满足治疗应用，常对适配体进行化学修饰（如2'-氨基、2'-氟、2'-O-甲基修饰和3'末端加帽）以增强其对抗内源性核酸酶的稳定性。为解决因分子量小（5-30 kDa）而导致的肾脏快速清除问题，与聚乙二醇（PEG）等大分子聚合物连接是延长循环半衰期的常用策略。镜像适配体（Spiegelmers）由非天然的L型构型糖组成，可避免核酸酶降解且免疫原性低。
与传统抗体相比，适配体具有高特异性、高亲和力、合成批次差异小、生产成本低、生产周期短、无需动物参与等优势。它们还具有优异的热稳定性和可重复使用性，并能耐受多次变性和复性。适配体易于进行位点特异性修饰和标记（如荧光团、纳米材料），且通常仅引发低至可忽略的免疫反应。其较小的尺寸有利于更深度的组织穿透和细胞靶向。此外，适配体还具有靶标结合诱导构象变化的独特能力，可用于新型检测策略。通过引入硫代修饰（硫代适配体）或通过点击化学引入官能团（X-aptamers），可进一步增强其稳定性和亲和力。
SELEX：从基础方法到先进平台
SELEX是一种强大的体外筛选方法，用于从庞大的随机寡核苷酸库（1012 至1015 个独特序列）中筛选出能高亲和力结合靶分子的适配体。经过三十年的发展，SELEX技术已演化出多种先进变体，旨在提高筛选效率、减少筛选轮次，并能使用复杂靶标同时保持其天然构象。
为规避靶标固定化带来的挑战，出现了适配体固定化SELEX（Capture-SELEX），该方法使靶标保持溶液状态，利于保留其天然构象。其他非固定化策略包括利用毛细管电泳的CE-SELEX、基于石墨烯氧化物吸附的GO-SELEX以及基于金纳米颗粒的AuNPs-SELEX。对于GBM等复杂生物靶标，Cell-SELEX至关重要，它使用活细胞作为靶标，能够在原生生理环境下筛选针对细胞表面标志物的适配体。该方法可通过反筛选步骤区分病变细胞和健康细胞。为降低脱靶风险，需要使用相关的正常细胞（如正常人星形胶质细胞、小胶质细胞或脑微血管内皮细胞）进行严格的负向筛选。此外，患者来源异种移植（PDX）模型和类器官模型因其能更好地保留原发肿瘤的异质性和更接近生理的血脑屏障，被认为是验证适配体特异性的优越工具。体内SELEX（in vivo SELEX）允许在活体生物体内直接筛选适配体，能直接考量生理和解剖屏障。
自动化SELEX平台和与新一代测序结合的HT-SELEX加速了发现进程。为克服传统SELEX的随机性局限，人工智能（AI）和机器学习（ML）算法被整合用于从头库设计和筛选后优化，例如AptaDiff生成扩散模型和AptaNet闭环模块化平台，能够有效预测和优化适配体与蛋白质的相互作用，减少所需筛选轮次。
胶质母细胞瘤的治疗挑战与适配体的优势
GBM是成人中最致命的原发性脑恶性肿瘤，标准疗法（最大范围手术切除、放疗和替莫唑胺化疗）后的中位总生存期仍不足8个月。治疗失败主要源于三个临床障碍：深刻的瘤内异质性、阻碍系统性治疗药物进入的血脑屏障（BBB）以及导致肿瘤再生和治疗抵抗的胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）库。
与替莫唑胺等存在系统毒性和耐药机制的小分子药物，或单克隆抗体因分子量大（150-180 kDa）而组织穿透性差相比，适配体具有显著的转化优势。其流体动力学半径小，有利于跨越BBB和深部肿瘤穿透。与制造复杂、存在神经毒性和抗原逃逸的CAR-T细胞疗法等新兴模式相比，适配体提供了一种非免疫原性的“化学抗体”替代方案，可以快速合成以靶向多个表位，从而克服GBM异质性带来的抗原变异。特别是，Cell-SELEX方法允许在无需预先了解靶标的情况下，分离针对GSCs表面天然标志物的配体，直接解决治疗抵抗和复发的根本原因。
针对特定GBM生物标志物的适配体
多种特定的分子靶点已被确定为适配体策略的目标，包括细胞外基质蛋白、生长因子受体和GSCs标志物。
腱生蛋白-C（TN-C）是一种在GBM间质中显著上调的多功能细胞外基质糖蛋白。靶向TN-C的适配体包括TTA1（一种核酸酶稳定的、尺寸最小化的RNA适配体）和GBI-10（一种DNA适配体）。它们已用于肿瘤模型的成像研究。
表皮生长因子受体（EGFR）及其致癌剪接变体EGFRvIII在约50%的GBM病例中过表达。已开发出多种能区分野生型EGFR和EGFRvIII的高亲和力DNA和RNA适配体（如U2、U8、E07、CL4RNv616），在临床前模型中显示出诊断成像和治疗潜力。
靶向GSCs的适配体对于消除导致复发的细胞群至关重要。例如，A40L/A40s RNA适配体靶向EphA2受体；DNA适配体A1-A6能结合肿瘤起始细胞（TICs）；WQY-9系列适配体识别胶质肉瘤细胞；GL21.T和Gint4.T RNA适配体分别靶向Axl和PDGFRβ受体。AS1411 DNA适配体靶向表面核仁蛋白，也被探索用于靶向GSCs。
整合素α5 β1 在GBM肿瘤细胞和新血管内皮上调。RNA适配体H02能特异性结合整合素α5 β1 ，并通-过受体介导的内吞作用内化，有望用于靶向递送。
全细胞SELEX作为一种强大的、无偏倚的策略，可直接发现识别GBM细胞天然表面分子特征的适配体，而无需预先了解特定抗原。例如，GBM128、GBM131、WYZ系列（WYZ-41a, WYZ-50a）以及GMT系列（GMT3, GMT4, GMT5, GMT8, GMT9）适配体，能特异性结合GBM细胞系或临床标本，在复杂生物体液中保持功能，并已用于靶向递送药物（如GMT8递送多西他赛纳米颗粒），在临床前模型中显示出应用潜力。
适配体-药物偶联物（ApDCs）
ApDCs通过利用核酸适配体的精确分子识别能力，将细胞毒性或调节性载荷直接递送至肿瘤细胞，从而在减轻脱靶毒性的同时放大抗肿瘤功效。ApDC通常由三个模块组成：靶向适配体、治疗性载荷（如小分子化疗药物、核酸药物、成像探针等）以及连接子（可设计为对内源性或外源性刺激响应以实现可控释放）。
共价偶联
共价偶联涉及在适配体和治疗载荷之间形成稳定的化学键。连接子可分为可切割型（如pH敏感、酶切、氧化还原响应）和不可切割型。
• 化疗药物递送 ：GR20 DNA适配体与阿霉素（DOX）共价偶联，通过点击化学合成，在GBM细胞中显示出抗增殖活性，且对正常成纤维细胞无毒性。AS1411适配体与紫杉醇（PTX）通过组织蛋白酶B可切割的二肽连接子连接，增强了PTX的水溶性和靶向性。
• 诊疗一体化 ：A40s适配体与近红外染料（IR700DX, ICG）共价连接，实现了GSCs的成像和光动力治疗。
• 跨越BBB ：靶向转铁蛋白受体（TfR）的RNA适配体与脂质（DSPE）共价结合，在小鼠中实现了极高的脑-血清比率，显示出跨越BBB的强大潜力。
• 纳米载体功能化 ：Gint4.T适配体（靶向PDGFRβ）用于功能化装载Dactolisib的共聚物纳米复合物，在临床前模型中显示出高效的内化和抗肿瘤效果。GMT8适配体被用于功能化装载多西他赛的纳米颗粒（ApNP）或银@金核壳纳米颗粒（GSGNPs），增强了治疗效果和放疗增敏。AS1411适配体被广泛用于功能化各种纳米颗粒（如PEG-PLGA, PGG-PTX, AsTNP cascade系统等），以增强药物递送、肿瘤积累和穿透。多功能系统RBT@MRN-SSTf/Apt结合了转铁蛋白和AS1411，用于GSH响应的化疗-光动力联合治疗。DOX装载的AS1411偶联纳米球实现了对核仁蛋白阳性GBM细胞的选择性靶向。
合成中掺入
此策略涉及在适配体合成过程中直接将小分子药物（主要是核苷类似物）整合到其序列中。药物可通过核酸酶活性在细胞内释放。
• 5-氟尿嘧啶（5FU）掺入 ：AIR-3-FdU（靶向hIL-6R）、SQ2-5FdU（靶向ALPPL-2）、E07-5FU（靶向EGFR）以及用氟尿苷（FUDR）替换胸苷的F-AS1411等适配体-药物偶联物，在各自靶向的癌症模型中显示出选择性细胞毒性和治疗效果。
• 药物适配体 ：一种创新策略是将适配体序列中的所有核苷酸全部替换为治疗性核苷类似物（如克拉屈滨、阿糖鸟苷、吉西他滨、氟尿苷），形成“药物适配体”。这些完全修饰的适配体在保留靶标结合亲和力的同时，本身具有诱导凋亡的治疗活性，为GBM治疗提供了新思路。
物理偶联
物理偶联主要依赖于适配体与治疗剂之间的非共价相互作用，如插层（ intercalation ）。
• 阿霉素（DOX）插层 ：DOX可插层到富含GC的DNA适配体序列中。AS1411-DOX复合物利用AS1411的G-四链体结构装载DOX，并在酸性环境下释放，显示出靶向递送效果。GMT-3:DOX复合物对GBM细胞表现出靶向特异性细胞毒性。基于ATP适配体的DNA支架可装载DOX，并在ATP丰富的肿瘤微环境中触发释放，在胶质瘤模型中显示出抗肿瘤效果。
多功能适配体系统
超越单靶点抑制，多功能适配体平台通过双适配体靶向或适配体-寡核苷酸嵌合体（AsiC）策略实现协同治疗。AsiC将靶向适配体与治疗性寡核苷酸（如siRNA、miRNA）共价连接，利用适配体实现细胞特异性递送。例如，Gint4.T适配体与STAT3 siRNA的嵌合体在GBM临床前模型中实现了特异性基因沉默和抗肿瘤效果。适配体也被用于递送靶向HDGF等生长因子的siRNA。
诊断与成像应用
适配体在GBM诊断和成像中展现出变革潜力，其特点包括高亲和力、特异性、易合成、低免疫原性和潜在的BBB穿透能力。
• 成像策略 ：适配体可轻松与多种成像模式（荧光、PET、MRI）结合。例如，AS1411已被用于荧光成像（Cy3/TGN）和PET成像（^64Cu-NOTA-AS1411）。靶向GSCs的A40s适配体与近红外染料结合，可用于可视化耐药细胞群。
• 特异性探针 ：DNA适配体Gli-55和Gli-233能特异性标记神经胶质瘤细胞和组织，在临床前模型中能清晰界定肿瘤边界，靶点分别为GFAP和TUBA1C。
• 液体活检 ：适配体为GBM的液体活检（检测血液或脑脊液中的循环肿瘤细胞CTC、细胞外囊泡EVs、循环核酸）提供了高灵敏度工具。双适配体（Gli-233/Gli-55）方法可高效捕获和富集患者血液中的CTC。
• 靶点特异性成像 ：靶向EGFRvIII的适配体（如U2, Aptamer 32）可用于分子成像和荧光引导手术。靶向TN-C的适配体（TTA1, GBI-10）可用于成像肿瘤微环境。靶向整合素α5 β1 的H02适配体在患者来源异种移植模型（PDX）中显示出优于抗体的穿透性和均匀结合。AS1411适配体已被整合到多种成像平台（量子点、磁性纳米颗粒等）。全细胞SELEX产生的适配体（如GMT系列、GBM128/131、WYZ系列、S6-1b）即使靶点未知，也能用于癌症特异性表位成像。
• BBB转运 ：通过工程化靶向BBB内皮细胞上的转运受体（如TfR），适配体可作为载体将诊断或治疗载荷递送入脑实质。靶向TfR的RNA适配体（如C1-Cy7）在小鼠模型中显示出高脑-血清摄取率。
临床转化与挑战
适配体疗法在GBM的临床转化仍处于早期阶段。最先进的候选药物是NOX-A12（olaptesed pegol），一种靶向CXCL12的L-RNA Spiegelmer，在GLORIA试验中与放疗和贝伐珠单抗联合用于新诊断的MGMT未甲基化GBM患者，显示出有希望的总生存期，并获得FDA快速通道资格。AS1411在其它癌症临床试验中显示出良好安全性，但其在GBM中的疗效尚待临床验证。
主要挑战包括：
1. 药代动力学 ：适配体分子量小，导致血清半衰期短，易被肾脏快速清除和核酸酶降解。化学修饰（如2'-氟、2'-O-甲基、硫代磷酸键）和PEG化是延长半衰期的关键策略。
2. 规模化生产 ：符合GMP标准的大规模生产面临高成本、严格监管和复杂基础设施的挑战。连续流合成和过程分析技术等先进制造工艺有望提高产量和一致性。
3. 免疫原性 ：未甲基化的CpG基序可能激活TLR9引发免疫反应。可通过甲基化修饰、使用特定核苷类似物或在SELEX设计中规避来降低风险。
未来需要整合化学修饰、偶联策略、可扩展的GMP生产工作流程以及系统性的免疫原性评估，以弥合临床前成果与临床成功之间的差距。在报告临床前研究时，需遵循动物实验报告指南，进行功效分析，并使用PDX模型验证，并准确报告生物分布数据（如%ID/g），以确保结果的可靠性和可重复性。
在监管方面，需遵循FDA和EMA关于寡核苷酸 therapeutics 的指南，重点进行免疫原性风险评估、脱靶效应表征以及符合CMC标准的严格质量控制。
Conclusions
适配体技术从根本上改变了GBM的治疗格局。从SELEX筛选到先进的多功能治疗和诊断平台，适配体展现出解决GBM关键挑战（如异质性、BBB、GSCs）的巨大潜力。尽管在药代动力学、规模化生产和监管方面仍存在挑战，但通过持续的技术创新和跨学科合作，适配体有望为GBM患者带来新的希望。
Declaration of generative AI and AI-assisted technologies in the writing process
在本文准备过程中，作者使用了MANUS工具来改进语法和语言润色以提高可读性。使用此工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物内容承担全部责任。
Declaration of competing interest
作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报道的工作。
打赏
