论文解读
在肿瘤免疫治疗领域，新抗原（neoantigen）被誉为“皇冠上的明珠”。它们是肿瘤细胞因基因突变而产生的异常蛋白质片段，被免疫系统视为“非我”物质，从而能够激活T细胞对肿瘤发起精准攻击。因此，新抗原不仅是免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）发挥疗效的关键，也是开发个性化癌症疫苗的理想靶点。
然而，寻找新抗原的道路充满挑战。目前，科学家们主要依赖全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing, WES）结合生物信息学预测来寻找新抗原。但这种方法存在明显局限：它只能覆盖约1.5%的人类基因组，无法检测到非编码区（如内含子、基因间区）产生的异常转录本。此外，短读长RNA测序（Short-read RNA-seq）虽然能覆盖更广的转录区域，但难以准确拼接出全长转录本，特别是那些由结构变异或异常剪接产生的“非经典”转录本。因此，尽管肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden, TMB）被广泛用作预测ICIs疗效的生物标志物，但其预测能力并不完美，许多高TMB患者对治疗无反应，而部分低TMB患者却能从治疗中获益。这强烈暗示，在传统方法无法触及的“暗物质”区域，还隐藏着大量未被发现的新抗原。
为了照亮这片“暗物质”区域，日本冈山大学、千叶癌症中心研究所等机构的研究团队在《Cell Reports》上发表了一项突破性研究。他们开发了一种全新的“蛋白质基因组学”（proteogenomic）策略，将能够读取全长转录本的长读长测序技术（Pacific Biosciences Single-Molecule Real-Time Sequencing, Iso-Seq）与能够直接捕获HLA（Human Leukocyte Antigen, 人类白细胞抗原）呈递肽段的免疫肽组学（Immunopeptidomics, IP-MS）相结合。通过这一策略，他们成功揭示了比传统方法多出数倍的、高度多样化的新抗原，并验证了这些新抗原能够被肿瘤特异性T细胞所识别，为开发更有效的免疫疗法开辟了新的道路。
关键技术方法
本研究整合了多种前沿技术。研究人员首先从4名黑色素瘤患者体内分离并建立了成对的肿瘤细胞系和肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）。利用单细胞RNA/TCR测序（scRNA/TCR-seq）技术，他们精准地定义了能够识别并攻击肿瘤的“癌症特异性T细胞克隆”。为了全面挖掘新抗原，研究团队对肿瘤细胞进行了全长转录组测序（Iso-Seq），以发现所有可能的异常转录本；同时，通过免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）技术，直接捕获并鉴定出肿瘤细胞表面HLA分子呈递的肽段。最后，通过构建串联小基因（tandem minigene）文库和T细胞受体（TCR）功能验证实验，他们成功地将特定的新抗原与对应的TCR进行了配对验证。
研究结果
1. 传统方法（WES）仅能识别极少数新抗原
研究人员首先利用传统方法对4名黑色素瘤患者的肿瘤细胞进行了分析。结果显示，尽管这些患者体内存在大量被激活的、能够攻击肿瘤的T细胞（癌症特异性CD8+ T细胞克隆），但通过WES预测出的新抗原数量与这些T细胞的数量之间没有相关性。更令人惊讶的是，当研究人员通过IP-MS直接检测肿瘤细胞表面HLA-I分子呈递的肽段时，在数千个被捕获的肽段中，仅发现了一个由WES预测出的突变肽段。通过功能验证，他们确认这个肽段确实是其中一个患者（MEL04）体内T细胞识别的靶点。这一结果证实，传统方法确实遗漏了绝大多数能够激活T细胞的新抗原。
2. 全长转录组测序（Iso-Seq）揭示了大量“隐秘”转录本
为了突破传统方法的局限，研究人员利用Iso-Seq技术对肿瘤细胞进行了全长转录组测序。结果发现，在检测到的所有转录本中，平均有32%是“新”的，即它们无法被现有的参考基因组数据库所注释。这些新转录本主要来源于新的剪接位点组合或基因间区。更重要的是，其中84%的转录本被预测为可以编码蛋白质。这表明，肿瘤细胞中存在着一个巨大的、未被探索的“隐秘”蛋白质组，其中很可能蕴藏着大量新抗原。
3. 结合Iso-Seq与IP-MS，发现大量“隐秘”新抗原
接下来，研究人员将Iso-Seq发现的潜在蛋白质序列与IP-MS捕获的HLA呈递肽段进行比对。他们发现，在HLA-I呈递的肽段中，平均有7.1%是“隐秘”肽段（cryptic peptides），即它们不包含在标准的蛋白质数据库中。这些“隐秘”新抗原的来源极其多样化，包括：
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翻译移码（Translational frameshift）：由于翻译过程中读码框发生偏移而产生的异常肽段，占37%。
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上游/下游序列：源自编码区上游（23%）或下游（18%）的非编码区。
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内含子保留（Intron retention）：占7.3%。
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其他来源：如内含子、基因间区、新外显子等。
这些发现表明，肿瘤细胞通过多种机制产生新抗原，而传统方法只能检测到冰山一角。
4. 功能验证：发现多个新抗原-TCR对
为了证明这些“隐秘”肽段确实是能够激活T细胞的真正新抗原，研究人员进行了严谨的功能验证。他们从患者体内筛选出多个“癌症特异性T细胞克隆”，并构建了相应的T细胞受体（TCR）。通过串联小基因文库筛选和肽段脉冲实验，他们成功鉴定出三个由CD8+ T细胞识别的HLA-I限制性新抗原。其中，一个肽段源自CPED1基因上游的非编码区，另外两个肽段则分别源自NAP1L4和RFX3基因的翻译移码。这些结果强有力地证明，通过Iso-Seq和IP-MS联合发现的“隐秘”肽段，确实是能够被免疫系统识别的功能性新抗原。
5. 发现HLA-II限制性新抗原
除了CD8+ T细胞，CD4+ T细胞在抗肿瘤免疫中也扮演着重要角色。研究人员将同样的策略应用于HLA-II呈递的肽段。他们发现，在HLA-II呈递的肽段中，同样存在大量“隐秘”肽段（平均占6.5%）。通过功能验证，他们成功鉴定出一个由CD4+ T细胞识别的HLA-II限制性新抗原，该肽段源自VPS8基因的内含子区域。这是首次通过这种蛋白质基因组学策略，直接鉴定出被CD4+ T细胞识别的功能性新抗原。
结论与讨论
本研究通过将全长转录组测序（Iso-Seq）与免疫肽组学（IP-MS）相结合，成功构建了一个强大的新抗原发现平台。该研究不仅证实了传统方法（WES）在识别新抗原方面的局限性，更重要的是，它揭示了肿瘤细胞中存在着一个远比想象中更为丰富和多样化的新抗原库。这些“隐秘”新抗原来源于非编码区、翻译移码、异常剪接等多种机制，是传统方法无法触及的“暗物质”。
这项研究的意义重大。首先，它为解决“TMB无法完美预测ICIs疗效”这一临床难题提供了新的解释：许多患者可能受益于这些“隐秘”新抗原，而非WES预测的突变。其次，该策略为开发更精准、更有效的个性化新抗原疫苗提供了新的靶点。最后，该研究发现的“隐秘”新抗原中，有一部分在不同患者之间是共享的，这为开发“通用型”新抗原疫苗带来了希望。
尽管本研究仅分析了4名黑色素瘤患者，但其揭示的原理和方法具有普适性。未来，随着测序技术和质谱技术的进一步发展，这种蛋白质基因组学策略有望在更大规模的队列中应用，从而更全面地揭示肿瘤免疫的奥秘，并最终推动肿瘤免疫治疗进入一个全新的时代。
