内质网应激相关超级增强子促进肝癌上皮 - 间质转化机制的研究解读

近期，安徽医科大学第一附属医院肿瘤科的研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Endoplasmic reticulum stress-related super enhancer promotes epithelial-mesenchymal transformation in hepatocellular carcinoma through CREB5 mediated activation of TNC” 的研究论文。该研究揭示了内质网应激（ERS）相关超级增强子（SE）通过 CREB5 介导激活 TNC 促进肝癌上皮 - 间质转化（EMT）的新机制，为深入理解肝癌进展机制及开发潜在治疗靶点提供了重要依据，对肝癌的防治研究具有关键意义。

一、研究背景

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，预后较差，其高复发和转移率严重威胁患者生命健康。深入探究肝癌肿瘤生长和转移的分子机制至关重要。

ERS 是由于内质网中未折叠或错误折叠蛋白积累引发的一种细胞应激反应，可激活未折叠蛋白反应（UPR）。已有研究表明，ERS 在肝癌发展中发挥重要作用，如促进血管生成、诱导自噬、降低肝癌细胞对化疗药物的敏感性等。同时，越来越多证据显示 ERS 与多种癌症的 EMT 激活密切相关，然而，ERS 影响肝癌中 EMT 的具体机制尚未完全明晰。

SE 是长度为 8 - 20kb 的长顺式作用元件，具有强大的转录增强活性，可驱动肿瘤细胞中许多关键癌基因的表达，在肝癌 EMT 调节中发挥重要作用。但 ERS 相关 SE 及其靶基因在肝癌发展和 EMT 中的作用有待进一步研究。

CAMP 反应元件结合蛋白 5（CREB5）作为一种转录因子，在多种癌症的发生发展中扮演重要角色。在肝癌中，CREB5 表达上调，且与患者预后不良和恶性进展相关，但其参与肝癌细胞 EMT 的具体机制，以及与 ERS 的关系尚不明确。

二、研究材料与方法

（一）研究对象与数据来源

研究使用了安徽医科大学第一附属医院的人类肝癌及癌旁正常肝组织样本，实验经医院伦理委员会批准，并获得患者书面知情同意。同时从 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 数据库获取 RNA - seq 数据和临床信息，从 EMT 相关数据库 dbEMT 获取 EMT 数据。

（二）细胞培养

选用 HepG2、Hep3B、Huh7、LM3、Hep1 - 6 和 MHCC - 97H 等细胞系，经检测无支原体污染。细胞培养于含 1% 链霉素、1% 青霉素和 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下培养，根据细胞生长情况适时换液。

（三）实验技术与方法

RNA - seq 和 ChIP - seq 分析：对衣霉素（TM）处理和未处理的 HepG2 细胞进行 RNA - seq，筛选差异表达基因（DEGs）；对 TM 诱导 ERS 的 HepG2 细胞进行 ChIP - seq 分析，检测 SE 变化，以确定 ERS 相关 SE 的潜在靶基因。
基因编辑技术：运用 CRISPR - Cas9 和 dCas9 - KRAB 技术，设计针对 CREB5 SE 区域的 sgRNAs，干扰 SE - 启动子相互作用，研究 CREB5 的功能。
蛋白质和基因表达检测方法：采用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测蛋白表达水平，利用实时荧光定量聚合酶链反应（RT - qPCR）检测 mRNA 表达水平，通过免疫组化染色（IHC）检测组织中蛋白表达，运用免疫荧光技术检测细胞内蛋白表达和定位。
细胞功能检测实验：借助 CCK - 8、克隆形成和 EDU 增殖染色实验评估细胞增殖能力；通过划痕实验和 Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力；利用 Annexin V - FITC/PI 凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测细胞凋亡情况。
双荧光素酶报告基因实验和 ChIP - qPCR：双荧光素酶报告基因实验用于探究 CREB5 对 TNC 启动子活性的影响；ChIP - qPCR 用于确定 CREB5 在 TNC 启动子区域的结合位点。
动物实验：选用 BALB/c 裸鼠进行动物实验，经动物伦理委员会批准。将转染后的 Hep3B 和 HepG2 细胞分别皮下注射到裸鼠体内，观察肿瘤生长情况，对肿瘤组织进行称重、IHC 染色等分析。
数据分析方法：实验数据以均值 ± 标准差表示，采用 t 检验比较两组样本均值，ANOVA 分析多组样本均值差异，卡方检验分析蛋白表达与临床参数的相关性，使用 Kaplan - Meier 法分析总生存期（OS），运用 GraphPad Prism 软件进行数据绘图和统计分析，以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。

三、研究结果

（一）CREB5 是肝癌中 ERS 相关 SE 的关键靶基因

研究人员对 TM 处理和未处理的 HepG2 细胞进行 RNA - seq，发现 1062 个差异表达基因，其中 601 个上调。通过 ChIP - seq 分析，检测到 197 个 ERS 特异性 SE 发生显著变化。利用在线工具筛选出 17 个 ERS 相关 SE 的潜在靶基因，经分析选择差异倍数最高的 CREB5 进一步研究。在 ERS - HepG2 细胞中检测到 SE 相关的 CREB5，且其上游非编码基因组区域的 H3K27ac 信号显著高于正常 HepG2 细胞。使用 BRD4 抑制剂 JQ1 处理 HepG2 细胞，有效抑制 BRD4 和 CREB5 表达，同时影响上皮和间质标记物表达。设计 sgRNAs 干扰 SE - 启动子相互作用，发现 sgRNA - 1 和 sgRNA - 2 可降低 CREB5 转录水平。

（二）CREB5 在肝癌中高表达且与预后不良相关

根据 TCGA 数据集，CREB5 在多种肿瘤组织中高表达。基因集富集分析（GSEA）显示，CREB5 高表达组中肿瘤相关基因显著富集。分析 TCGA - LIHC 数据集发现，肝癌组织中 CREB5 水平显著高于正常组织，且与组织学分级、残留癌、血管侵犯等相关。生存分析表明，CREB5 高表达降低患者总生存期（OS）和疾病特异性生存期。对 96 例肝癌患者组织芯片进行 IHC 染色，证实肿瘤组织中 CREB5 表达高于癌旁正常组织，且高表达与肿瘤大小和分化程度相关。对 38 例肝癌患者随访发现，CREB5 高表达患者预后更差。收集 8 对新鲜肝癌和癌旁组织进行 Western blotting，再次验证肝癌组织中 CREB5 高表达。

（三）ERS 激活上调肝癌中 CREB5 表达

用不同浓度 TM 处理 HepG2 细胞，Western blotting 和 RT - qPCR 结果显示，CREB5 和葡萄糖调节蛋白 78（GRP78，ERS 标志物）表达呈剂量依赖性增加。使用 ERS 抑制剂 4 - 苯基丁酸（4 - PBA）处理，可抑制 TM 诱导的 CREB5 和 GRP78 上调。免疫荧光实验表明，TM 处理后 CREB5 表达增加且定位于细胞核，4 - PBA 处理则降低其表达。对 96 对肝癌和癌旁组织进行 IHC 染色，发现 CREB5 和 GRP78 在肝癌组织中高表达，且两者表达呈正相关。CREB5/GRP78 双阳性患者的 OS 更短。生物信息学分析 TCGA 数据显示，CREB5 与 ERS 相关下游基因正相关。

（四）CREB5 促进肝癌体内外增殖

分析多个肝癌细胞系中 CREB5 表达，发现其在 Hep3B 和 LM3 细胞中相对较高，在 HepG2 和 Huh7 细胞中较低。在 Hep3B 和 LM3 细胞中敲低 CREB5，在 HepG2 和 Huh7 细胞中过表达 CREB5，通过 CCK - 8、克隆形成和 EDU 增殖染色实验发现，敲低 CREB5 显著抑制 Hep3B 和 LM3 细胞增殖，过表达 CREB5 则促进 HepG2 和 Huh7 细胞增殖。动物实验表明，敲低 CREB5 显著降低 Hep3B 细胞皮下移植瘤的重量和体积，过表达 CREB5 则增加 HepG2 细胞移植瘤的大小和重量。IHC 显示，敲低 CREB5 降低 Ki67 表达，过表达 CREB5 则增加 Ki67 表达。

（五）CREB5 促进肝癌细胞迁移、侵袭并抑制凋亡

通过划痕实验和 Transwell 实验，发现敲低 CREB5 减少 Hep3B 和 LM3 细胞的迁移和侵袭能力，过表达 CREB5 则增强 HepG2 和 Huh7 细胞的迁移和侵袭能力。敲低 CREB5 降低 Bcl - 2 表达，增加 Bax 表达，促进细胞凋亡；过表达 CREB5 则抑制凋亡，流式细胞术结果进一步证实了这一点。

（六）ERS 通过 CREB5 促进 EMT

用 TM 处理 HepG2 细胞诱导 ERS，RT - qPCR 和 Western blotting 结果显示，TM 降低 E - cadherin 表达，增加 N - cadherin 和 vimentin 表达，4 - PBA 处理可逆转这些变化。Spearman 相关性分析表明，CREB5 与 EMT 标志物、细胞外基质（ECM）降解及相关基因正相关。GSEA 显示，CREB5 与 ECM 受体相互作用、ECM 组织、基质金属蛋白酶（MMPs）和 PI3K - AKT 信号通路显著相关。在肝癌细胞系中，敲低 CREB5 增加 E - cadherin 表达，降低 N - cadherin、vimentin 和 Snail 表达；过表达 CREB5 则相反。同时，敲低 CREB5 降低 MMP2 和 MMP9 表达，过表达 CREB5 则增加其表达，在小鼠肝癌细胞系 Hep1 - 6 中也得到类似结果。

（七）TNC 是 CREB5 的下游效应因子

分析 TCGA 中 CREB5 高、低表达组的基因表达谱，结合 RNA - seq 数据和 EMT 相关基因集分析，发现 TNC 是 CREB5 调节 EMT 的关键靶基因。在多个肝癌细胞系中敲低或过表达 CREB5，RT - qPCR 和 Western blotting 结果显示，TNC 的 mRNA 和蛋白水平随 CREB5 变化而变化。双荧光素酶报告基因实验和 ChIP - qPCR 证实，CREB5 可结合 TNC 启动子，促进其转录。GSEA 富集分析表明，TNC 与 ECM 组织、黏着斑和 PI3K - AKT - mTOR 信号通路密切相关，且 CREB5 与 TNC 正相关，ERS 可增加 TNC 表达，4 - PBA 可抑制这种上调。

（八）CREB5 通过 TNC 促进肝癌细胞 EMT

在 Hep3B 细胞中用 siRNA 敲低 TNC，RT - qPCR 和 Western blotting 验证敲低效率。结果显示，敲低 TNC 显著抑制细胞迁移和侵袭，降低 EMT、MMP2 和 MMP9 蛋白水平，促进细胞凋亡，增加细胞对 lenvatinib 的敏感性。在稳定过表达 CREB5 的 HepG2 细胞中敲低 TNC，可抑制 CREB5 介导的细胞侵袭和迁移，以及对 EMT 的促进作用。

四、研究结论与讨论

本研究首次证实，ERS 激活通过 ERS 特异性 SE 的关键靶基因 CREB5 促进肝癌细胞 EMT。CREB5 在肝癌组织中显著上调，与不良预后和侵袭性表型相关。CREB5 直接结合 TNC 启动子，促进其转录，进而推动 EMT 进程。这一发现揭示了 ERS 调节 EMT 的新机制，为阻断肿瘤转移策略的开发提供了有价值的见解。

在肝癌复发和转移的研究中，理解其致病机制和表观遗传变化至关重要。EMT 在肿瘤侵袭和转移中起关键作用，促进了肝癌的进展。此前研究表明，SE 可通过驱动 EMT 相关转录因子的转录促进 EMT，本研究进一步证实，ERS 通过调节 SE，影响 CREB5 转录，进而调控肝癌细胞的 EMT 过程，表明 ERS 与肝癌的 EMT 和侵袭性密切相关。

TNC 作为 ECM 糖蛋白，在多种癌症中高表达，与恶性进展和不良预后相关。本研究明确 TNC 是 CREB5 调节 EMT 的关键靶基因，CREB5 通过调控 TNC 表达影响肝癌细胞的迁移、侵袭、EMT 和凋亡过程，敲低 TNC 可抑制 CREB5 诱导的相关促进作用，为肝癌治疗提供了潜在的新靶点。

尽管本研究取得重要进展，但仍存在一些问题。ERS 与 EMT 之间的复杂关系有待深入研究，可能涉及多种机制同时激活，并非单一途径调节。此外，SE 通常在三维结构中调节相关基因表达，其如何在三维空间中与 CREB5 转录起始位点相互作用以调控转录，需要进一步探索。尽管如此，本研究为 ERS 促进 EMT 的机制提供了新视角，突出了超级增强子和 CREB5 作为肝癌潜在治疗靶点的重要性，为后续肝癌治疗研究奠定了基础，有望推动肝癌治疗策略的创新与发展。