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自身免疫性疾病抗中性粒细胞细胞质抗体（ANCA）相关血管炎（AAV）的病因尚不清楚。在这里，作者将表达抗髓过氧化物酶（MPO） IgM的记忆B细胞，以及抗MPO IgM和IgG的存在与AAV疾病的病理生理联系起来，以暗示潜在的治疗靶点。
来自莱顿大学医学中心（Leiden University Medical Center）等多个单位的研究人员，在Nature Communications期刊上发表了题为 “Anti-myeloperoxidase IgM B cells in antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis” 的论文。该研究对于深入理解抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（AAV）的发病机制具有重要意义，为后续开发更精准有效的治疗策略提供了关键依据，也为研究其他自身免疫性疾病中自身反应性 IgM 的作用开辟了新的思路。
许多人类自身免疫性疾病都与疾病特异性自身抗体相关，在多数这类疾病中，B 细胞靶向治疗有效，这表明 B 细胞在疾病发病机制中起着关键作用。然而，B 细胞具体如何参与疾病进程却往往不明确。抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（AAV）是一种典型的由 B 细胞介导的自身免疫性疾病，其特征为存在疾病特异性 IgG，会引发小血管炎症和威胁器官的组织损伤，目前尚无治愈方法。不同的抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA） - IgG 与不同的临床综合征相关，如抗蛋白酶 3（PR3）的 ANCA 常与肉芽肿性多血管炎（GPA）相关，而抗髓过氧化物酶（MPO）的 ANCA 则是显微镜下多血管炎（MPA）和较少见的嗜酸性 GPA（EGPA）的标志。AAV 的严重表现包括肺泡出血和坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN），可导致不可逆的器官损伤甚至危及生命。尽管目前针对 B 细胞和补体系统的治疗在一定程度上改善了 AAV 的疾病管理，但疾病复发常见且难以预测，多数患者仍需长期接受免疫抑制治疗，这带来了诸多副作用，感染已成为患者死亡的主要原因。因此，明确 B 细胞在 AAV 疾病复发和缓解中的具体病理生理作用至关重要。
此前的研究多聚焦于疾病特异性自身反应性 IgG，而对 AAV 中产生 ANCA 的特异性 B 细胞反应研究较少。本研究旨在表征 MPO + AAV 患者中针对 MPO 的自身反应性 B 细胞反应，以揭示其在疾病发病机制中的潜在作用。
研究人员收集了健康供体（n = 22）和 MPO + AAV 患者（n = 18）的外周血样本。患者来自莱顿大学医学中心风湿病科或肾内科的门诊或因疾病发作住院的患者。此外，还从莱顿、格罗宁根、弗莱堡三个机构收集了 MPO + AAV 队列的额外血清样本。所有参与者均签署了书面知情同意书，研究获得了相关伦理审查委员会的批准。
从人中性粒细胞中纯化或商业获取髓过氧化物酶（MPO），并将其与 Alexa Fluor 647（AF647）或 R - 藻红蛋白（PE）结合用于后续实验。使用针对人 MPO（266 - 6k1）和 PR3（266 - 1k2）的鼠杂交瘤细胞系开发和验证 MPO 特异性染色方案。实验中用到多种抗体，包括抗 CD3、抗 CD14、抗 CD19 等，用于细胞分选和表型鉴定。
MPO 特异性 B 细胞染色与检测：开发 MPO 抗原特异性流式细胞术染色方案，通过标记 MPO 并与抗 IgG 抗体结合，在杂交瘤细胞系上验证该方案的有效性，随后应用于 MPO + AAV 患者和健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）染色，分离 MPO 特异性 B 细胞并进行培养和后续分析。
细胞培养与抗体检测：将 PBMCs 或富集的 B 细胞在含有细胞因子的培养基中培养，培养上清液通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗 MPO 抗体的产生。对不同 B 细胞亚群（如 CD19 + IgD + CD27 - 、CD19 + IgD - CD27 + 、CD19 + CD27 ++ CD38 +++ ）进行分选和培养，同样检测抗 MPO 抗体。
B 细胞受体测序与单克隆抗体制备：对产生抗 MPO 抗体的单 B 细胞培养孔进行 RNA 提取、cDNA 合成和免疫球蛋白重链可变区（IGHV）及轻链（IGK/IGL）的 PCR 扩增和测序。选择部分抗 MPO - IgM 和抗 MPO - IgG BCR 序列制备单克隆抗体（mAbs），并通过多种方法检测其 MPO 反应性和特异性。
补体激活实验：通过 ELISA 检测抗 MPO - IgM mAbs 与 MPO 结合后 C1q 的沉积情况，评估其激活补体的能力。对 MPO + AAV 患者和对照的血浆进行大小排阻色谱分离 IgM 和 IgG 组分，检测各组分结合 MPO 后激活补体的能力。
利用标记的 MPO 对表达抗 MPO 或抗 PR3 B 细胞受体的杂交瘤细胞系进行染色，结果显示只有表达抗 MPO 的 266 - 6k1 细胞能结合 MPO，且结合与表面 IgG 表达相关，预孵育未标记的 MPO 可阻断阳性信号，表明成功建立了以表面 IgG 依赖和抗原特异性方式可视化抗 MPO 表达 B 细胞的方法。
对 MPO + AAV 患者和健康供体的 PBMCs 进行染色和单细胞培养，患者来源的单细胞培养孔中总 Ig 产生普遍，多数患者的 Ig 对 MPO 有反应，而健康供体中仅有一个 B 细胞产生 MPO 反应性抗体。进一步分析发现，患者中 MPO 特异性 B 细胞反应主要由 CD27 + IgM + B 细胞主导，IgG + MPO 特异性细胞较少。对 MPO 反应性克隆的 BCR 测序显示，未发现寡克隆反应，IgM 反应性克隆中 59% 存在体细胞突变。制备的抗 MPO - IgM mAbs 和抗 MPO - IgG mAb 均显示出 MPO 反应性，且抗 MPO - IgM mAbs 作为 B 细胞受体具有功能活性。
临床实践中常用抗 MPO - IgG 而非抗 MPO - IgM 进行诊断和监测。研究通过抗原特异性染色、细胞分选和培养实验发现，MPO + AAV 患者循环中抗 MPO - IgM 表达 B 细胞占主导。进一步实验证实，虽然健康供体中也存在可分泌抗 MPO - IgM 的 B 细胞，但在患者中，来自 MPO 特异性 IgD - CD27 + B 细胞的抗 MPO - IgM 和 - IgG/-IgA 更容易检测到。对多个队列患者血清的检测表明，多数患者抗 MPO - IgG 阳性，同时相当数量患者抗 MPO - IgM 水平升高，且二者存在中度相关性。
研究发现抗 MPO - IgM mAbs 与 MPO 结合后能导致 C1q 沉积，激活补体。对患者血浆的分析显示，抗 MPO - IgM 组分激活补体的能力强于抗 MPO - IgG 组分，在患者血浆中抗 MPO - IgM 在抗 MPO - Ig 诱导的补体激活中起主导作用。
本研究直接在体外鉴定、分离和表征了人类 AAV 中 MPO 特异性 B 细胞。研究发现 MPO + AAV 患者中 MPO 特异性、IgM 表达的记忆 B 细胞频率显著升高，这些细胞可能分化为分泌 IgM 的浆细胞，产生的抗 MPO - IgM 能强烈激活补体级联反应，这一未被充分认识的 IgM 细胞群可能在 AAV 的炎症过程中发挥重要作用，其效应功能可能与抗 MPO - IgG 的功能互补，促进补体激活，进而影响 AAV 的疾病进程。
在许多自身免疫性疾病中，B 细胞靶向治疗虽有一定效果，但疾病复发等问题突出。本研究聚焦 AAV，发现抗 MPO - IgM B 细胞反应是此前被忽视的自身免疫反应组成部分。IgM 作为早期免疫防御的重要成分，其在 AAV 患者中的存在可能反映了近期 B 细胞的刺激，推测与疾病活动和复发相关。此前对 AAV 中抗 MPO - IgM 的研究有限且结果不一，本研究通过多中心队列研究证实了患者血清中抗 MPO - IgM 的存在，但其与临床疾病活动和复发的关系仍需进一步研究。
目前尚不清楚 B 细胞对人 MPO 的耐受性是如何及何时被打破的。健康供体血浆中未检测到抗 MPO - IgM，但部分健康供体的未成熟 B 细胞经刺激后可分泌该抗体，且在 AAV 患者中发现表达未突变的 MPO 特异性 IgM - BCR 克隆，这表明 MPO 反应性可能存在于健康和疾病状态下的生殖系编码 BCR 库中，MPO 反应性 B 细胞可能逃避早期耐受性检查点并易受刺激。AAV 患者中抗 MPO - IgM B 细胞记忆和类别转换的抗 MPO - IgG 的存在可能与感染等环境因素有关，但具体触发因素仍有待确定。
本研究存在一定局限性，如 AAV 患者细胞研究数量较少，部分分析因细胞数量有限无法进行，单细胞培养的生长率未达 100% 可能影响结果，且无法排除患者和健康供体中 MPO 特异性 B 细胞在生存、亲和力和 Ig 分泌能力上的差异，同时未在体内研究抗 MPO - IgM 的功能。尽管如此，本研究为进一步研究 AAV 不同临床阶段的自身反应性 B 细胞反应开辟了新途径，也为其他自身免疫性疾病中自身反应性 IgM 的研究提供了参考，对于指导临床研究和开发针对 AAV 的靶向治疗具有重要意义。未来研究可进一步扩大样本量，进行纵向研究，并开展体内实验深入探究抗 MPO - IgM 在 AAV 中的作用机制和临床意义。
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