PPP2R1A突变导致卵巢透明细胞癌中ATR抑制剂敏感性

卵巢透明细胞癌新发现：PPP2R1A 突变与 ATR 抑制剂敏感性关联研究解读

来自英国癌症研究院（The Institute of Cancer Research）的 James Stewart 等人在肿瘤学领域知名期刊Oncogene上发表了题为 “PPP2R1A mutations cause ATR inhibitor sensitivity in ovarian clear cell carcinoma” 的论文。该研究揭示了蛋白磷酸酶 2A（PP2A）亚基编码基因 PPP2R1A 的突变与卵巢透明细胞癌（OCCC）对 ATR 抑制剂敏感性之间的重要联系，为 OCCC 的精准治疗提供了潜在的生物标志物和新的治疗靶点，对改善 OCCC 患者的治疗现状具有重要意义。

一、研究背景

OCCC 是上皮性卵巢癌的一种亚型，占所有上皮性卵巢癌的 5%-15%。与其他类型卵巢癌相比，OCCC 患者发病年龄较早，且多在疾病早期被发现。然而，晚期 OCCC 对标准化疗药物具有较强的耐药性，二线化疗的有效率极低，仅为 0 - 8%，预后也比分期相同的高级别浆液性卵巢癌更差。因此，探寻针对 OCCC 的靶向治疗方法迫在眉睫。

OCCC 在基因层面具有独特特征，其 TP53 基因多为野生型，BRCA1 或 BRCA2 基因突变频率较低，这意味着使用铂类药物或 PARP 抑制剂治疗可能效果不佳。在 OCCC 中，SWI/SNF 肿瘤抑制基因 ARID1A 的截断突变最为常见，40 - 57% 的病例存在该突变。此外，PIK3CA、PPP2R1A、TERT 启动子、SYNE1、KRAS 等基因的突变以及 ERBB2、AKT2 的扩增也有发现。

此前研究发现，在 OCCC 的临床前模型中，ARID1A 功能缺失与 ATR 抑制存在合成致死效应，基于此开展了评估 ATR 抑制剂 ceralasertib 治疗晚期 ARID1A 缺陷型妇科癌症的 II 期临床试验。同时，研究人员采用功能基因组学方法，试图寻找影响 ARID1A/ATRi 合成致死性的遗传修饰因子，进而发现了 PPP2R1A 基因突变与 ATR 抑制剂敏感性的关联。

二、研究材料与方法

（一）细胞系

研究使用了多种细胞系，包括从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得的 TOV21G 细胞系，以及来自 Horizon Discovery 的 HCT116 ARID1A 等基因细胞系对，还有从 Dr Hiroaki Itamochi 处获得的 OVISE 和 OVTOKO 细胞系。所有细胞系均在添加了 10% 胎牛血清和 100 单位 /mL 青霉素 - 链霉素的 RPMI 1640 培养基中培养，并定期检测细胞系身份和支原体感染情况。

（二）实验方法

1. 细胞活力测定：通过将细胞接种于 96 孔或 384 孔板，加入不同浓度的药物，在培养特定时间后，使用 CellTiter-Glo? 试剂测定细胞活力，计算存活分数并绘制剂量反应曲线，采用双向方差分析（two-way ANOVA）确定差异显著性。

2. 全基因组 CRISPRn/i 筛选：构建表达可诱导 SpCas9 或组成型表达催化失活 dCas9-KRAB 的细胞系，利用慢病毒感染将针对 18,010 个基因的 sgRNA 文库导入细胞，经药物处理后，提取基因组 DNA，扩增 sgRNA 序列并进行深度测序，分析筛选结果以确定影响 ATR 抑制剂敏感性的基因。

3. CRISPR prime 基因编辑构建模型：运用 PE2 系统对 TOV21G 细胞进行 CRISPR prime 基因编辑，将编辑后的细胞进行单细胞分选、扩增和基因分型，从而获得携带特定 PPP2R1A 突变的细胞系。

4. siRNA 基因沉默实验：在 384 孔板或 6 孔板中进行反向转染，使用 siRNA SMARTpool 和阴性对照 siCON2，转染后获取细胞裂解物或进行活力实验。

5. 蛋白质免疫印迹分析（Western blot）：使用 RIPA 缓冲液提取全细胞裂解物，经预制的 Bis-Tris 凝胶电泳分离蛋白质，利用特定的一抗检测 PPP2R1A、PPP2R2A、PPP2CA 和 vinculin 等蛋白的表达水平。

6. 细胞周期分析：对细胞进行药物处理，在处理的最后 2h 加入 EdU，后续经固定、染色后，利用流式细胞术检测 EdU 染色、磷酸化组蛋白 H3 染色和 DNA 含量，分析细胞周期分布。

7. 免疫荧光：将细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，药物处理后固定、透化、封闭，与一抗孵育过夜，再与相应的二抗孵育，最后用含有 DAPI 的封片剂封片，使用显微镜成像并分析 53BP1 bodies 和微核的数量。

8. 时间推移显微镜观察：将细胞接种于 96 孔成像板，加入核染色剂、微管蛋白探针和肌动蛋白探针，药物处理后每 5min 成像一次，持续 24h，手动测量有丝分裂细胞在中期的持续时间。

9. 体内评估 ATR 抑制剂敏感性：将表达荧光素酶的 TOV21G 细胞接种到 BALB/c 裸鼠的腹腔中，待肿瘤形成后，随机分组给予低剂量 AZD6738 或溶媒处理，定期使用 IVIS 成像系统监测肿瘤生长情况，同时监测动物体重，依据相关标准决定动物的安乐死时机。

10. 蛋白质组学样本制备与分析：裂解细胞沉淀，进行蛋白质浓度测定、还原、烷基化和酶切等处理，使用 TMTpro 试剂标记肽段，经液相色谱 - 质谱联用（LC-MS）分析，在 Proteome Discoverer 2.4 软件中进行肽段鉴定和定量，使用 Perseus 平台进行蛋白质组学数据的统计分析，并将质谱蛋白质组学数据上传至 ProteomeXchange Consortium。

11. 患者来源样本测序：对皇家马斯登医院（RMH）NHS 基金会信托研究中的肿瘤样本进行 ARID1A 突变检测（采用靶向捕获面板）和 PPP2R1A 基因分型（采用 Sanger 测序）。

三、研究技术路线

1. 首先通过全基因组 CRISPR-Cas9 诱变筛选，在 ARID1A 突变的 TOV21G OCCC 细胞中寻找除 ARID1A 外影响 ATR 抑制剂敏感性的基因，发现 PP2A 亚基编码基因 PPP2CA 和 PPP2R2A 与 ATR 抑制剂敏感性相关。

2. 为进一步验证，在非肿瘤上皮细胞系 MCF10A p53mutant 中进行额外的 CRISPR 诱变和干扰筛选，确定 PPP2CA、PPP2R1A 和 PPP2R2A 均为 ATR 抑制剂敏感性的决定因素。

3. 对 OCCC 队列中的 PPP2R1A 进行基因分型，发现 52% 的病例存在 p.R183 位点的杂合错义突变，且部分 ARID1A 突变病例同时伴有 PPP2R1A 突变。

4. 利用 CRISPR-prime 编辑技术在 TOV21G 细胞中引入 PPP2R1A p.R183P 或 p.R183W 突变，构建等基因模型，从细胞和分子水平研究突变对 ATR 抑制剂敏感性的影响。

5. 将携带 PPP2R1A 突变的 TOV21G 细胞和野生型细胞进行裸鼠体内移植实验，给予低剂量 AZD6738 处理，观察肿瘤生长情况，评估 PPP2R1A 突变在体内对 ATR 抑制剂敏感性的影响。

四、研究结果

（一）全基因组 CRISPR-Cas9 筛选确定 PP2A 亚基为 OCCC 中 ATR 抑制剂敏感性的遗传决定因素

研究人员在对 ARID1A 突变的 TOV21G OCCC 细胞进行全基因组 CRISPR-Cas9 诱变筛选时，通过比较经 AZD6738 处理和溶媒（DMSO）处理的细胞中 sgRNA 的频率，确定了影响 ATR 抑制剂敏感性的基因。结果显示，靶向 PP2A 亚基 PPP2CA 和 PPP2R2A 的 sgRNA 可导致细胞对 ATR 抑制剂敏感，这一结果在后续对非肿瘤上皮细胞系 MCF10A p53mutant 进行的 CRISPR 诱变和干扰筛选中得到进一步证实。综合这些数据表明，PP2A 的缺陷会在多种细胞环境中导致细胞对 ATR 抑制剂敏感，且该效应不完全依赖于 ARID1A 或 p53 的状态。

（二）PPP2R1A p.R183W 和 p.R183P 突变导致 OCCC 肿瘤细胞出现 ATR 抑制剂诱导的 S 期应激、早熟有丝分裂进入、基因组不稳定和 ATR 抑制剂敏感性

对 23 例 OCCC 病例的 PPP2R1A 基因进行基因分型发现，52% 的病例存在 p.R183 位点的杂合错义突变，在 ARID1A 突变的病例中，33% 同时伴有 PPP2R1A 突变。研究人员利用 CRISPR-prime 编辑技术在 TOV21G 细胞中引入 p.R183P 或 p.R183W 突变，构建了等基因模型。研究发现，这些突变导致 PP2A 复合物中 PPP2R2A 和 PPP2CA 的总水平降低，且使先前已知可被 PP2A 去磷酸化的位点发生磷酸化富集，表明细胞存在 PP2A 缺陷。功能实验表明，携带 p.R183P 或 p.R183W 突变的 TOV21G 细胞对 ATR 抑制剂更为敏感。进一步研究发现，ATR 抑制剂处理后，PPP2R1A p.R183 突变细胞的复制 S 期细胞比例显著降低，pH3 阳性细胞比例增加，且出现更多 DNA 含量 < 4N 的 pH3 阳性细胞，表明细胞出现早熟有丝分裂进入。同时，突变细胞中 53BP1 bodies 数量增加，有丝分裂中期持续时间延长，部分细胞无法完成有丝分裂而发生凋亡，微核数量也显著增加，这些结果均表明 PPP2R1A 突变细胞存在基因组不稳定。

（三）PPP2R1A/ATRi 合成致死效应在体内发挥作用

研究人员将携带 PPP2R1A 野生型和 p.R183W 突变的 TOV21G 细胞分别接种到裸鼠腹腔中，待肿瘤形成后，给予低剂量 AZD6738 或溶媒处理。结果显示，在没有 PPP2R1A 突变的情况下，低剂量的 ATR 抑制剂对肿瘤生长影响较小；而在存在 PPP2R1A 突变时，AZD6738 能够显著抑制肿瘤生长，且该剂量的药物对动物体重和身体状况影响较小。这表明 PPP2R1A 突变在体内同样能够增强肿瘤细胞对 ATR 抑制剂的敏感性。

五、研究结论与讨论

（一）研究结论

本研究发现 PPP2R1A 基因 p.R183 位点的致癌热点突变能够增强 OCCC 临床前模型对 ATR 抑制剂的敏感性，这种效应在体外细胞实验和体内动物实验中均得到证实。PPP2R1A 突变导致细胞对 ATR 抑制剂敏感的特征包括细胞周期中复制 S 期细胞减少、进入有丝分裂的亚 4n 基因组含量细胞增加以及 53BP1 bodies 积累等。此外，研究还发现 PPP2R1A 突变在 OCCC 中具有一定的发生频率，提示在评估 ATR 抑制剂治疗 OCCC 的反应时，除了 ARID1A 基因外，还应评估 PPP2R1A 的状态，其有可能作为预测 ATR 抑制剂敏感性的生物标志物。

（二）讨论

该研究成果为 OCCC 的治疗提供了新的思路和潜在的生物标志物，但研究也存在一些局限性。首先，虽然目前的研究表明 PPP2R1A 突变与 ATR 抑制剂敏感性相关，但这一结论还需要未来在患者根据这两个基因的突变状态进行预分层的临床试验中进一步验证。理想情况下，此类试验应具有足够的规模，以便评估 ARID1A 或 PPP2R1A 基因突变对 ATR 抑制抗肿瘤疗效的影响，以及两者同时突变对 ATR 抑制剂反应的影响。其次，本研究对 PPP2R1A 突变及其对 ATR 抑制剂敏感性影响的建模主要基于对 PPP2R1A 野生型 TOV21G 细胞的基因编辑，而其他常用的 OCCC 肿瘤细胞系已存在致癌的 PPP2R1A 突变，无法用于建立等基因模型研究突变的影响。未来可利用患者来源的异种移植模型（PDX）进一步研究，但这需要更多的努力来获取合适的 PDX 模型。此外，PP2A 可作用于多个底物，目前尚未确定导致 PPP2R1A 突变细胞对 ATR 抑制剂敏感的关键底物，未来研究可通过全细胞蛋白质组学和磷酸蛋白质组学技术，更全面地了解 PPP2R1A 突变后蛋白质组的变化，以明确关键底物。

总体而言，该研究首次揭示了 PPP2R1A 突变与 OCCC 对 ATR 抑制剂敏感性之间的联系，为 OCCC 的精准治疗提供了重要的理论依据和潜在的治疗靶点，对推动 OCCC 的临床治疗发展具有重要意义。未来的研究将围绕上述局限性展开，进一步深入探索 PPP2R1A 突变在 OCCC 治疗中的作用机制，有望为 OCCC 患者带来更有效的治疗方案。