在细胞这个微观的世界里，过氧化物酶体（peroxisomes）可是个 “大忙人”。它就像一个小小的工厂，承担着多种重要的代谢功能，比如脂肪酸的 β- 氧化，为细胞提供能量。不仅如此，它还参与了许多其他生化途径，在人类、真菌、植物等不同生物体内发挥着独特的作用。在人类中，过氧化物酶体要是出了问题，可就麻烦大了，像 Zellweger 综合征等疾病，就是因为过氧化物酶体的生物发生蛋白发生突变导致的。

科学家们还发现，过氧化物酶体可不只是一个简单的 “大口袋”，它内部有着复杂的结构。一些代谢酶会聚集在特定的区域，形成电子致密核心（electron dense cores），这些核心就像是工厂里的 “小车间”，把不同的酶分隔开来。不过，这个 “小车间” 为什么会形成，里面的 “布局” 有什么讲究，一直是困扰科学家们的谜题。而且，不同生物体内的过氧化物酶体还存在着差异，比如在真菌里，它参与了次生代谢产物和铁载体的生物合成；在植物中，不同发育阶段会出现不同类型的过氧化物酶体。另外，过氧化物酶体的蛋白质输入机制也很有意思，有 Pex5 和 Pex7 这两种 “运输小能手”，它们能识别特定的序列基序，把蛋白质运送到过氧化物酶体中。

为了揭开这些谜团，来自 [第一作者单位] 的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了一篇名为 “Protein self - assembly drives peroxisome core formation and metabolic compartmentalization” 的论文。他们发现，蛋白质的自我组装是过氧化物酶体核心形成的关键，这种核心结构能够将过氧化物酶体的内腔进行分隔，从而形成具有不同酶含量的过氧化物酶体亚群。这一发现就像是找到了打开过氧化物酶体神秘大门的钥匙，对于我们理解细胞代谢和过氧化物酶体的功能有着重要的意义。

研究人员在这项研究中用到了多种技术方法。他们运用显微镜技术，包括荧光显微镜（epifluorescence microscopy）、结构光照明显微镜（structured illumination microscopy，SIM）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM），来观察过氧化物酶体的结构和蛋白质的定位；通过生化实验，如制备粗细胞器、进行洗涤剂处理等，来研究蛋白质的聚集和定位特性；还利用了分子生物学技术，对相关基因进行克隆和表达分析。这些技术方法相互配合，就像一套精密的 “组合拳”，帮助研究人员一步步揭开过氧化物酶体的奥秘。

下面来看看研究人员具体都有哪些重要发现。

研究人员之前发现，在玉米黑粉菌（Ustilago maydis）中，有两种酰基转移酶 Mac1 和 Mac3，它们参与了表面活性甘露糖赤藓糖醇脂质（MELs）的生物合成，并且都定位在过氧化物酶体中。这次，他们想进一步看看这两种酶在过氧化物酶体中的分布情况。于是，他们让细胞表达绿色荧光蛋白标记的 GFP - Mac1 和 GFP - Mac3，以及过氧化物酶体标记蛋白 mCherry - SKL。通过荧光显微镜观察，他们惊讶地发现，Mac1 和 Mac3 在过氧化物酶体中的分布并不均匀，它们只在一部分过氧化物酶体中高度富集。

为了弄清楚这是怎么回事，研究人员用油酸处理细胞，油酸能促使过氧化物酶体增殖。结果发现，在油酸培养基中，Mac 蛋白与 mCherry - SKL 的共定位明显减少，很多含有 mCherry - SKL 的过氧化物酶体甚至都没有 Mac 蛋白。而且，研究人员还做了各种对照实验，比如交换荧光标签、共表达其他融合蛋白等，都证明了这种不同的过氧化物酶体亚群的形成是一种自然发生的生物学现象。

接着，研究人员用结构光照明显微镜（SIM）对细胞进行观察，发现 GFP - Mac1 和 GFP - Mac3 集中在过氧化物酶体的亚域中，这些亚域通常位于过氧化物酶体的边缘，而 mCherry - SKL 和 GFP - SKL 则分布在整个细胞器的内腔中。通过 3D 重建技术，他们更加直观地看到了这些亚域的形成，而且这些含有 Mac1/3 的亚域还很稳定，不会轻易变化。

过氧化物酶体亚群是怎么形成的呢？是蛋白质选择性地进入特定的过氧化物酶体，还是在过氧化物酶体腔内发生了什么特别的过程呢？研究人员通过一个脉冲追踪实验来寻找答案。他们让 mCherry - SKL 持续表达，而 GFP - Mac3 则在阿拉伯糖诱导和葡萄糖抑制的启动子控制下表达，这样就能追踪新合成的 GFP - Mac3 的定位变化。同时，他们还构建了 GFP 标记的酰基辅酶 A 氧化酶（GFP - Aox1）作为对照，因为 GFP - Aox1 在过氧化物酶体中是均匀分布的。

实验结果显示，刚开始 GFP - Mac3 和 GFP - Aox1 在过氧化物酶体中都是均匀分布的，但随着时间推移，GFP - Mac3 会在特定的焦点处积累，与 mCherry - SKL 的共定位也减少了，而 GFP - Aox1 则没有这种变化。研究人员还发现 GFP - Mac3 似乎比 GFP - Aox1 更不稳定，不过即使敲除了过氧化物酶体中负责降解错误折叠蛋白的 LON 家族蛋白酶的同源基因，过氧化物酶体亚群依然会形成。这表明过氧化物酶体亚域是在蛋白质导入后形成的，而且过氧化物酶体亚群的形成与 GFP - Mac3 的降解以及亚域在过氧化物酶体分裂时的分离有关。

研究人员还对 PTS1 导入途径进行了研究。他们发现，PTS1 蛋白 C 末端的 12 个氨基酸对靶向信号的效率有影响。分析 GFP 与 Mac1 和 Mac3 的 C 末端含有 PTS1 的十二聚体融合蛋白的定位后，发现只有 GFP - PTS1_Mac3会在亚群中积累并集中在亚域中，而 GFP - PTS1_Mac1则均匀分布在腔内。进一步的截断分析表明，Mac3 的 C 末端九聚体肽能显著增强 GFP 与 mCherry - SKL 的共定位，而其中的 Thr - Ile - Ile - Val（TIIV）四肽基序更是能让 GFP 在过氧化物酶体亚域和亚群中高效聚集。把这个基序插入到其他蛋白中，也能让这些蛋白形成焦点结构，而且这个基序的功能不局限于过氧化物酶体，融合到线粒体标记蛋白上，也能让 GFP 在线粒体中或线粒体上的焦点结构中富集。通过构建 TIIV 基序的单氨基酸替代变体，研究人员确定了这个基序对于亚域形成是必要且充分的。同时，通过计算机分析和体外聚集实验，发现 TIIV 基序可能促进蛋白质的自组装，这就像是给蛋白质们发出了一个 “集合信号”，让它们聚集在一起形成特定的结构。

早期对哺乳动物过氧化物酶体的研究发现，核心结构中含有尿酸氧化酶。研究人员想知道在玉米黑粉菌中是不是也有类似的情况。于是，他们构建了融合绿色荧光蛋白的尿酸氧化酶（GFP - Uox1），结果发现 GFP - Uox1 和 Mac 蛋白一样，也会在焦点处积累，并分离到一部分过氧化物酶体中。共表达 GFP - Uox1 和 mCherry - Mac1 或 mCherry - Mac3 时，它们有很高的共定位度。

之前有研究报道过氧化物酶体核心结构能抵抗非离子洗涤剂的处理，研究人员也进行了类似的实验。他们制备了粗细胞器提取物，用 Triton X - 100 处理后，发现 mCherry - SKL 的检测对洗涤剂很敏感，而荧光标记的 Mac1、Mac3 和 Uox1 在点状结构中仍然可见。透射电子显微镜结合免疫金标记也证实了 GFP - Mac3 在过氧化物酶体腔内的焦点积累，甚至含有 TIIV - SKL 的焦点也是洗涤剂抗性结构。这说明 TIIV 基序就像是一把 “万能胶水”，能促进蛋白质自组装形成洗涤剂抗性核心。而且，研究人员还发现 Mac1 和 Mac3 定位到核心是相互独立的，即使没有对方，它们也能找到自己的 “归宿”。

研究人员推测，核心结构可能有助于过氧化物酶体的代谢分区。他们首先检测了 GFP - Mac3 和 GFP - Mac3 - V₅₇₀R 在体内的活性，通过薄层层析（TLC）和液相色谱 - 质谱（LC - MS）分析从氮饥饿细胞中分离出的 MELs，发现表达这两种酶产生的 MELs 数量和变体分布都相似，这表明核心形成对糖脂生物合成并没有明显的帮助。

酰基辅酶 A 氧化酶 Aox1 是典型的 β- 氧化酶，研究人员发现它不会随着时间在核心中富集，另外两种可能参与 β- 氧化的酰基辅酶 A 氧化酶也是如此。于是，他们猜测核心中的选择性积累可能是为了将不参与 β- 氧化的酶（如 Mac 蛋白和尿酸氧化酶）与 β- 氧化酶分开，从而促进脂肪酸的有效分解。为了验证这个猜测，他们比较了表达 GFP - Mac3 和 GFP - Mac3 - V₅₇₀R 的细胞在以油酸为唯一碳源的培养基上的生长情况。结果发现，表达 GFP - Mac3 的细胞在固体培养基上的菌落外观与表达 GFP - Mac3 - V₅₇₀R 的细胞不同，GFP - Mac3 - V₅₇₀R 细胞的菌落边缘有明显的丝状化，这是一种典型的应激现象。通过测量液体培养物在以油酸为唯一碳源时的耗氧量，研究人员发现 GFP - Mac3 - V₅₇₀R 细胞在从葡萄糖转换到油酸时，初始耗氧率较低，耗氧加速也明显不同，这说明 Mac3 在核心中的积累能够实现腔内分区，支持过氧化物酶体的高效代谢。

除了 Mac3，其他酶的积累会不会也能实现代谢分区呢？研究人员以尿酸氧化酶 Uox1 为例进行研究。虽然 Uox1 没有 TIIV 基序，但它有一个类似的 TRIV 基序，这个基序也能驱动 GFP 在核心中富集。把 Uox1 蛋白中第 124 位的缬氨酸换成精氨酸后，GFP - Uox1 的定位完全改变，无法形成核心。体外聚集实验也表明，Uox1 - V₁₂₄R 的聚集速度更慢，聚集程度更低。

含有改变后的 Uox1 - V₁₂₄R 变体的细胞，在表型上与含有 GFP - Mac3 - V₅₇₀R 的细胞相似，它们在以油酸为碳源的培养基上生长时，都出现了异常的菌落形态，而且耗氧量也减少了。这说明这两种不同的酶，如果不能正常富集在过氧化物酶体核心中，而是均匀分布在细胞器腔内，就会干扰过氧化物酶体的功能。

研究人员还测试了其他含有预测 PTS1 的蛋白质的定位，发现很多蛋白质都能富集在核心结构中，其中一些含有 TIIV - 样基序，还有一些没有这种基序的蛋白质也能形成焦点定位，这表明可能存在更多冗余的组装基序。这些在核心中富集的蛋白质包括预测的 D - 氨基酸氧化酶 Dao1 和苹果酸合酶 Mls1 等，它们的功能各不相同，这说明核心结构就像一个 “大杂烩”，把各种不同功能的酶聚集在一起，实现代谢分区。而且，D - 氨基酸氧化酶和尿酸氧化酶在哺乳动物过氧化物酶体核心中也存在，这暗示了这种现象在进化上是保守的。

核心形成的原理在进化上保守吗？研究人员把小鼠尿酸氧化酶 MmUox1 标记上绿色荧光蛋白，在玉米黑粉菌细胞中表达，发现 GFP - MmUox1 与 mCherry - Mac3 的重叠度比与 mCherry - SKL 的更高，而且经过洗涤剂处理后，含有 GFP - MmUox1 的结构依然稳定。

他们还把 GFP - TIIV - SKL 和 mCherry - SKL 共转染到人类视网膜色素上皮 1（RPE1）细胞中，通过结构光照明显微镜观察，发现 GFP - TIIV - SKL 在 RPE1 细胞的过氧化物酶体特定亚域中积累。把 GFP - TIIV - SKL 与 mCherry 标记的 MmUox1 共表达时，它们有很高的共定位度。甚至来自构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的 HexA 蛋白，在玉米黑粉菌中异源表达时，也能与 Mac3 共定位，并富集在洗涤剂抗性结构中。这表明过氧化物酶体核心结构的形成在不同物种中遵循相似的原理，Woronin 体可能就是核心的一种更特殊的进化变体。

在讨论部分，研究人员总结了他们的研究成果。过氧化物酶体核心一直以来都是个神秘的存在，虽然早就被发现，但它的生物学功能却不为人知。这次研究表明，核心能够实现过氧化物酶体的腔内分区，形成不同蛋白质组成的过氧化物酶体亚群。核心中积累了多种功能不同的酶，但不包括脂肪酸氧化的关键酶，这些酶参与了次生代谢、产生过氧化氢等过程。而且，在哺乳动物细胞中也发现了类似的现象，这说明通过核心形成来实现代谢分区可能是一种进化上保守的机制。

不过，研究人员也指出，玉米黑粉菌核心结构的生物物理性质还不清楚，它到底是像尿酸氧化酶和甲醇氧化酶那样的晶体结构，还是像肾细胞中 D - 氨基酸氧化酶凝聚物那样有独特的特征，还需要进一步研究。TIIV 基序虽然被发现是核心组装的重要功能基序，但它可能只是一个更复杂机制的一部分。了解这些基序，有助于研究人员通过微小的序列改变来研究错误定位到过氧化物酶体腔内的蛋白质，为进一步探索过氧化物酶体的功能提供了新的方向。

这项研究对于我们理解过氧化物酶体的功能和细胞代谢有着重要的意义。它就像一盏明灯，照亮了过氧化物酶体这个神秘的微观世界，让我们对细胞内的代谢分区机制有了更深入的认识，也为后续研究不同生物体内过氧化物酶体的功能和进化提供了重要的基础。未来，科学家们可能会基于这些发现，进一步探索过氧化物酶体与其他细胞过程的联系，以及如何利用这些知识来治疗相关疾病，让我们拭目以待吧！