对乙酰氨基酚降解研究：污水处理厂中的关键发现与意义
在日常生活中，对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）作为一种广泛使用的解热镇痛药，就像一位 “常客”，频繁出现在我们的药箱里。它每年的全球产量超过 160,000 吨，仅中国的产量就占比超 50%。特别是在新冠疫情期间，其生产和消费量更是大幅增长。然而，这种药物具有高水溶性，多余药物、人类和动物粪便以及医院和制药厂的排放，都使得它轻松地进入了水环境，摇身一变成为了水生微污染物。在废水、地表水、地下水甚至饮用水中，都能检测到它的身影，其浓度范围从 ng/L 到 mg/L 不等。它不仅会对水生生物造成危害，还可能通过生物积累和食物链传递，威胁人类健康，其转化产物如 N - 乙酰 - p - 苯醌亚胺（NAPQI）还具有肝毒性，过量接触会导致肝损伤，孕期接触 APAP 也与胎儿发育不良以及神经发育和泌尿生殖系统疾病风险增加有关。
面对 APAP 带来的种种环境问题，微生物降解成为了一个极具潜力的解决方向。此前，虽然有研究成功分离出了能够降解 APAP 的纯培养物，并提出了相关分解代谢途径，但在真实环境中，微生物群落与 APAP 之间的相互作用、APAP 降解基因的分布特征，以及这些基因如何驱动 APAP 的命运走向，依旧是未解之谜。为了深入探索这些问题，上海交通大学生命科学与生物技术学院等研究机构的研究人员开展了一项关于 APAP 在污水处理厂（Wastewater Treatment Plants，WWTPs）微生物降解过程的研究，相关成果发表在《Microbiome》上。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们采集了中国 20 个污水处理厂的水样（样本队列来源），通过液相色谱 - 质谱（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）分析来定量检测 APAP 及其代谢产物对氨基苯酚（p -aminophenol，PAP）的浓度。利用宏基因组分析全面研究参与 APAP 降解的微生物群落和功能基因，同时进行功能微生物分离、酶活性测定和微生物多样性分析，进一步阐明 APAP 在污水处理厂环境中的转化机制。
研究结果主要包括以下几个方面：
- APAP 降解及其中间产物 PAP 的积累：在检测的 WWTPs 样本中，PAP 的浓度显著高于其母体化合物 APAP。APAP 在 19 个样本中被检测到，浓度范围为 0.06 - 29.20 nM，而 PAP 在所有样本中均有检出，浓度范围为 23.93 - 108.68 nM。这表明 APAP 水解为 PAP 的速度比下游降解步骤更快，可能是因为 WWTPs 中 APAP 水解酶的丰度较高和 / 或其酶活性较强。
- APAP 降解酶的不均衡丰富度：APAP 降解途径始于多种酰胺酶对 APAP 的初始水解。研究发现，参与 APAP 初始水解的酰胺酶在 WWTPs 中更为常见，而大多数下游酶，除了 ApdB 外，很少被观察到。这表明 APAP 降解酶的不平衡分布模式可能是导致 PAP 在 WWTPs 中积累的原因。对 WWTPs 宏基因组的分类分析显示，含有初始酰胺酶的微生物门与含有下游酶的微生物门之间存在明显差异，其中放线菌门（Actinomycetota）与初始酰胺酶的存在密切相关。
- APAP 酰胺酶的广泛多样性：研究人员以之前报道的功能性 APAP 酰胺酶为查询序列，从 WWTPs 样本的宏基因组中检索其同源序列，构建了序列相似性网络（Sequence Similarity Network，SSN）。结果显示，ApaH2 与 WWTPs 中最丰富的酰胺酶序列聚类，而 DmhA、TccA 和 AmpA 分别与第二、第三和第四丰富的序列聚类，这表明 WWTPs 中存在独特的 APAP 酰胺酶群体和丰富的未表征酰胺酶。
- 分离菌株对 APAP 的降解：研究人员从 APAP 污染的废水样本中分离出了两种 APAP 利用菌，即 Pandoraea sp. strain NyZ501 和 Rhodococcus sp. strain NyZ502。在 NyZ501 中鉴定出与之前报道的 APAP 降解基因 aaa 相同的基因，该基因可能在革兰氏阴性菌中水平转移。而在 NyZ502 中未检测到 aaa 基因，当 NyZ502 在含有 APAP 的培养基中培养时，APAP 随时间明显被生物转化，PAP 作为中间产物被检测到，但该菌株在 PAP 上无法生长，可能是因为其 APAP 降解基因集不完整或 PAP 衍生物限制了其生长。
- APAP 酰胺酶 ApaA 的表征：对 Rhodococcus sp. strain NyZ502 进行基因组测序，发现了一种与 APAP 水解相关的假定酰胺酶 ApaA。ApaA 在同源宿主 Rhodococcus erythropolis L88 中过表达和纯化后，证实其在 APAP 降解中具有明显活性，在 20 分钟内可将 APAP 完全转化为大约化学计量当量的 PAP。ApaA 的最佳 pH 约为 7.5，最佳温度约为 65°C，在高达 37°C 的温度下至少稳定 30 分钟，保留约 70% 的活性，但对 45°C 以上的温度敏感。与已知的 APAP 酰胺酶 AAA 相比，ApaA 对 APAP 的亲和力更高（Km=8.96μM，显著低于 AAA 的Km 22.13 µM），而 AAA 的催化效率则得益于更高的底物周转率。
- ApaA 在 WWTPs 中的高丰度：在 WWTPs 的测序宏基因组中搜索 ApaA，发现其同源物高度丰富，甚至超过了大多数之前报道的功能性 APAP 酰胺酶。将包含 ApaA 和不包含 ApaA 的所有报道的 APAP 酰胺酶同源物进行比较，构建 SSN，结果表明 ApaA 类序列对 WWTPs 中 APAP 酰胺酶的多样性和序列丰度有显著贡献。
- APAP 降解基因在重建的 MAGs 中的分布：研究人员成功重建了 211 个高质量的宏基因组组装基因组（Metagenome-Assembled Genomes，MAGs），进行 MAG 水平的分析。结果显示，在 MAGs 中，拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Pseudomonadota）和放线菌门（Actinomycetota）是最主要的门类。APAP 降解基因在整个途径中的分布在 MAG 水平上也存在偏差，APAP 酰胺酶基因，包括本研究中鉴定的 apaA，比下游降解基因显著更丰富，且 apaA 主要存在于放线菌门中，这表明分类学差异在 APAP 分解代谢中起着关键作用。
- WWTPs 中酰胺酶的序列和结构多样性：基于从 WWTPs 宏基因组中检索到的序列进行系统发育分析，鉴定出至少 15 个不同的系统发育组，功能鉴定的酰胺酶主要分布在其中的一些组中，如 DmhA 在 F 组，TccA 在 G 组，ApaH2 在 I 组，AmpA 在 J 组，而 H 组包含 ApaA、AAA、ApaH1 和 Mah 等序列，是最丰富的组。结构分析显示，这些酰胺酶至少存在四种不同的蛋白质折叠，这种结构多样性表明 WWTPs 中的酰胺酶可能具有不同的酶功能和底物特异性，有助于 APAP 的微生物分解代谢。
- APAP 降解酶的全球分布：研究人员下载了代表不同地理位置的 117 个 WWTPs 样本的原始测序读数，创建了全球 WWTPs 宏基因组数据集。通过 BLASTP 搜索发现，初始 APAP 酰胺酶，特别是 ApaA 和 ApaH2，在大多数地点的丰度明显高于下游酶，这表明 APAP 降解酶在全球范围内分布不均。
研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 APAP 在 WWTPs 中的环境降解过程中涉及多种功能基因，APAP 降解过程中中间产物 PAP 的显著积累是由于负责 APAP 上游和下游降解的基因之间存在意外的不平衡。宏基因组分析发现中国多个 WWTPs 中 APAP 降解基因存在显著多样性，初始降解酶的优势表明 APAP 在这些地点能够广泛且高效地水解，但下游降解酶的相对稀缺是 APAP 完全矿化的瓶颈，这可能导致更有毒的 PAP 积累。此外，研究还证实了环境微生物对异生物质降解具有多样的代谢途径，酰胺酶基因在不同门中的广泛存在表明在 WWTPs 等多源汇聚的环境中，微生物群落之间可能存在水平基因转移（Horizontal Gene Transfer，HGT），这可能是由 APAP 等药物污染物的选择压力驱动的。PAP 在 WWTPs 中的积累对环境和公共健康构成了重大威胁，因为它比 APAP 更具毒性，可能会导致生态风险增加。该研究为开发增强的生物修复策略提供了明确的目标，例如构建工程化微生物群落，优化初始和下游 APAP 降解酶的表达，以减少有害中间产物 PAP 的积累；还可以通过合成生物学技术设计微生物菌株，使其过表达 PAP 降解酶，提高 PAP 转化为毒性较低化合物的转化率。此外，基于生物反应器的方法可以优化生物降解条件，结合代谢途径建模和微生物组建模，有助于选择最佳菌株和生物降解设置，以最大化 APAP 和 PAP 的分解效率。尽管这些工程化微生物群落和生物反应器解决方案具有很大的潜力，但在大规模 WWTPs 中的应用仍面临一些挑战，如微生物稳定性和新技术与现有基础设施的整合，以及成本效益等问题。
总的来说，这项研究深入揭示了 APAP 在污水处理厂中的复杂降解动态，强调了微生物群落和多样的微生物途径在这一过程中的重要作用。同时，研究发现的 APAP 降解过程中的问题，也为后续的研究和技术开发指明了方向，对于解决药物污染物对环境和人类健康的影响具有重要意义。
生物通微信公众号
