### 引言
肺炎链球菌（
Streptococcus pneumoniae）感染是全球细菌性肺炎的主要病因，可引发侵袭性肺炎球菌疾病（IPDs）如脑膜炎、败血症，以及非侵袭性疾病（non-IPDs）如鼻窦炎、中耳炎 ，对儿童和老年人危害极大。肺炎球菌结合疫苗（PCVs）虽能预防 IPDs，但在中国未纳入国家免疫规划，接种率低，对肺炎链球菌感染负担影响有限。
血清型是肺炎链球菌侵袭性、流行程度和疫苗靶向性的关键决定因素。PCVs 引入后，疫苗型（VT）肺炎链球菌减少，非疫苗型（NVT）增加，出现 “血清型替代” 和 “血清型转换” 现象。血清型转换指血清型相关基因位点改变，由重组驱动，需持续监测。14 型曾是 IPDs 主要病因，在国外 PCVs 推广后流行率下降，但在中国 14/CC876 克隆占主导且疫苗反应有限，CC876 菌株基因组可塑性高但特征不明。本研究旨在鉴定 CC876 复合物中的耐药 NVT 菌株，分析新型 15B/ST4749 菌株的起源及潜在风险。
材料和方法
- 临床监测、细菌分离和抗生素耐药性鉴定：在中国南方沿海城市对儿童肺炎链球菌感染进行回顾性研究，从 166 例患者分离菌株，用哥伦比亚血琼脂基础培养基培养，按 VITEK 2 系统和相关标准鉴定抗生素耐药谱。
- 总 DNA 提取和全基因组测序：用 Genomic DNA Kit 提取 DNA，NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit 制备文库，在 Illumina NovaSeq 6000 平台测序。用 FastQC 评估数据，SPAdes 软件组装，Prokka 进行基因预测和注释。
- 系统发育分析：将组装基因组映射到肺炎链球菌台湾 19F - 14 的完整基因组序列，用 Snippy 软件鉴定单核苷酸多态性（SNPs），RAxML 构建最大似然系统发育树，iTOL 在线工具可视化。
- MLST 和血清型分析：用 MLST 数据库进行多位点序列分型（MLST），确定等位基因计数和序列类型（STs）。用 SeroBA 通过比对关键基因确定血清型。
- 检测 AMR 基因、VF 基因和插入序列：用 BLAST 将序列与 Resfinder、VFDB、ISfinder 数据库比对，检测抗菌耐药（AMR）基因、毒力（VF）基因和插入序列。用 Student’s t - test 分析 VT 和 NVT 样本中 AMR 基因数量差异。
- 重组检测：用 Gubbins 软件筛选重组区域，基于 Perl 脚本分析cps区域侧翼基因组结构，PROKSEE 服务器生成基因组图。
结果
- 患者入组和样本收集：研究纳入 166 例 5 岁以下厦门儿童肺炎链球菌感染患者，平均年龄 28.39 个月，男女比例 90:76。主要临床诊断为呼吸道感染引发的肺炎（146 例），多数标本（158/166）来自呼吸道。
- 疫苗型和非疫苗型血清型的系统发育关系：166 株菌株分属 18 种血清型，78.3%（130/166）为 VT 血清型。PCV7 和 PCV13 对住院儿童的覆盖率分别为 63.25% 和 78.31%，对年幼儿童更有益。VT 和 NVT 血清型菌株在系统发育上相关，提示可能发生血清型转换。
- VT 向 NVT 血清型转换的多重耐药肺炎链球菌序列型 4749 变体：血清型与 ST 存在复杂关系，18 种血清型中 8 种与特定 ST 相关，10 种与多种 ST 相关。研究发现 5 种血清型转换事件，其中 14 型向 15B 型转换值得关注，新定义的 15B/ST4749 菌株可能源于 14/ST4749 菌株，经分析确定了可能的供体、受体菌株及重组片段和相关基因。
- 血清型转换的特定基因组特征：研究观察到 3 种新型 ST4749 菌株，与 ST876 菌株相比aroE基因有两个错义突变。ST4749 菌株比 ST876 菌株基因数更多且有插入序列，这些是否影响cps位点重组有待研究。
- 分离株的抗菌耐药特征和耐药基因携带情况：VT 肺炎链球菌对多数抗生素耐药率高于 NVT 菌株，但对红霉素和氯霉素耐药率低于 NVT 菌株。共鉴定出 19 种 AMR 基因，VT 菌株携带 AMR 基因数量多于 NVT 菌株，19A/19F 血清型菌株携带特定耐药基因。
讨论
肺炎链球菌严重威胁全球健康，疫苗在预防儿童肺炎链球菌肺炎中作用关键，但 NVT 血清型流行率上升，VT 菌株耐药基因更多，NVT 菌株耐药性也需持续监测。本研究证实了血清型转换现象，但未充分考虑其他可能解释。未来研究应纳入更多菌株，深入探究肺炎链球菌 VT 向 NVT 血清型转变机制，加强对肺炎链球菌血清型和基因型动态监测。
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