研究背景
HIV-1（人类免疫缺陷病毒 1 型）作为一种逆转录病毒，专门感染并破坏人体的 CD4⁺免疫细胞，是引发艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）的罪魁祸首。在病毒与细胞的 “战争” 中，HIV-1 的衣壳扮演着极为关键的角色。当病毒和细胞的膜相互融合后，装满病毒基因组和复制酶的衣壳就会 “溜” 进被感染细胞的细胞质中。这个衣壳呈独特的锥形，由大约 250 个六聚体和 12 个五聚体的衣壳蛋白（CA）精心搭建而成。为了能让新合成的病毒双链 DNA 成功整合到宿主基因组中，衣壳必须经历 “拆解”（解聚）过程。
目前，抗逆转录病毒疗法（ART）虽能将 HIV-1 感染者体内的病毒复制抑制到难以检测的水平，有效防止病毒传播，但长期使用会使病毒产生耐药性，大大降低治疗效果。因此，研发针对 HIV-1 复制不同环节的新型抗逆转录病毒药物迫在眉睫。HIV-1 衣壳因其在病毒生命周期中的关键作用，成为了极具潜力的抗病毒药物靶点。
PF-3450074（PF74）和 Lenacapavir（LEN，GS-6207）就是两种针对 HIV-1 衣壳的抑制剂。PF74 能与 CA 六聚体中相邻 CA 单体组成的疏水口袋紧密结合，抑制病毒复制，不过它的代谢稳定性较差。而 LEN 则是一类全新的、超强效（EC₅₀约为 23 pM）且长效的 HIV-1 衣壳抑制剂，已获得欧盟和美国食品药品监督管理局批准，用于治疗多重耐药的 HIV-1 感染。尽管它们都能抑制 HIV-1 感染早期的多个步骤，可对于它们在感染细胞中对 HIV-1 衣壳的具体影响，科学家们还知之甚少。
研究方法
为了深入了解 LEN 和 PF74 对 HIV-1 衣壳的影响，研究人员采用了一系列巧妙的实验方法。他们分别用绿色荧光蛋白融合 CA（GFP-CA）和液相 GFP 内容标记物（cmGFP）来标记 HIV-1 衣壳。通过这种方式，就像给衣壳穿上了不同颜色的 “荧光外衣”，可以清晰地观察它们的变化。
在实验过程中，研究人员先利用之前描述的方法，将表达 cmGFP 或 GFP-CA 的 HIV-1 质粒与表达野生型（WT）Gag 的 HIV-1 质粒共转染到 293T 生产细胞中，从而生产出带有荧光标记的病毒。然后，使用蔗糖密度梯度离心法从病毒体中分离出成熟的病毒核心，再通过荧光显微镜和蛋白质免疫印迹（Western blot）技术对其进行可视化观察和分析。
此外，研究人员还进行了免疫染色实验，用 Alexa Fluor 647 标记的抗 GFP 抗体（anti-GFP (AF647)）来检测 GFP-CA 和 cmGFP 的可及性，以此判断它们在衣壳中的位置。同时，通过在表达 MX2（一种能抑制 HIV-1 核输入的宿主限制因子）的 HeLa 细胞中进行感染实验，研究 GFP-CA 整合到衣壳晶格中是否会改变病毒对 MX2 限制的敏感性。
研究结果
- 病毒核心的分离与标记特性：成功利用蔗糖梯度沉降法从病毒体中分离出了标记有 GFP-CA 或 cmGFP 的成熟病毒核心，并且可以通过荧光显微镜清楚地观察到它们。研究发现，成熟病毒核心中标记的 GFP-CA 或 cmGFP 信号强度与未成熟病毒颗粒有明显差异。其中，GFP-CA 病毒核心的 GFP 信号强度比未成熟的 GFP-CA 病毒颗粒低，这是因为只有一小部分 GFP-CA 像 CA 一样组装进了成熟衣壳；而 cmGFP 病毒核心的 GFP 信号强度比未成熟颗粒更低，这是由于大部分 cmGFP 在病毒融合后会立即丢失。
- GFP-CA 和 cmGFP 的位置差异：用 anti-GFP (AF647) 抗体对分离的病毒核心进行检测时发现，大部分（约 92%）成熟核心部分的 GFP-CA 颗粒能被有效检测到，而 cmGFP 颗粒只有极少数（约 7%）能被检测到。这表明 GFP-CA 位于成熟病毒核心的外部，能与抗体接触，而 cmGFP 则在病毒核心内部。同时，用抗 MA（基质蛋白）抗体检测发现，成熟核心部分还含有少量未成熟病毒颗粒，这些未成熟颗粒可以通过其较高的 GFP 强度与成熟核心区分开来。
- GFP-CA 对病毒敏感性的影响：在研究 GFP-CA 整合到衣壳晶格对病毒敏感性的影响时发现，在不表达 MX2 的 HeLa 细胞中，未标记病毒和 cmGFP 标记病毒的感染性相似，而 GFP-CA 标记病毒的感染性相对较低。在表达 MX2 的 HeLa 细胞中，未标记病毒和 cmGFP 标记病毒的感染性显著降低，但 GFP-CA 标记病毒的感染性相对未标记病毒和 cmGFP 标记病毒更高，这说明 GFP-CA 整合到衣壳晶格中可以减少病毒对 MX2 限制的敏感性，进一步证明了 GFP-CA 是整合到衣壳晶格且位于衣壳外部的，而 cmGFP 则作为病毒核心完整性的标记。
- LEN 对病毒核心的影响：通过对分离的病毒核心进行实验，研究人员发现 LEN 对病毒核心的影响十分独特。在体外实验中，用 LEN 处理 GFP-CA 病毒核心时，随着 LEN 浓度的增加，病毒核心的数量呈剂量依赖性增加，这表明 LEN 能稳定衣壳晶格，防止其在 20 分钟的孵育过程中解体。然而，用 LEN 处理 cmGFP 病毒核心时，病毒核心数量却显著减少，这意味着 LEN 会破坏病毒核心的完整性。同时，电子显微镜观察发现，LEN 处理后的病毒核心出现了断裂和异常形态，主要表现为在窄端断裂或呈现其他破损形态以及异常形状。
- PF74 对病毒核心的影响：与 LEN 不同，用 10 µM PF74 处理分离的病毒核心时，GFP-CA 病毒核心的数量明显减少，且其 GFP 强度也大幅下降，这说明 PF74 不仅会导致病毒核心完整性丧失，还会使衣壳晶格大量丢失。对于 cmGFP 病毒核心，PF74 处理后其数量同样显著减少，剩余颗粒的 GFP 强度与未成熟病毒颗粒相似，表明这些可能是对 PF74 不敏感的未成熟病毒颗粒。电子显微镜观察也显示，PF74 处理后的病毒核心大多断裂或形态异常。
- LEN 和 PF74 对核输入的影响：在研究 LEN 和 PF74 对 HIV-1 核心核输入的影响时，发现 PF74 会抑制病毒核心与核膜的结合，从而阻止核输入；而 LEN 则不影响病毒核心与核膜的结合，但会抑制病毒核心从核膜转移到细胞核内。具体来说，用不同浓度的 PF74 处理细胞时，会减少核膜处的 GFP-CA 病毒核心数量；而用 LEN 处理时，较低浓度（0.2 nM）的 LEN 虽不破坏病毒核心完整性，但能抑制核输入，较高浓度（1.0 nM）的 LEN 虽会破坏病毒核心完整性，但病毒核心仍能与核膜结合。
研究讨论
本研究利用 GFP-CA 和 cmGFP 这两种互补的病毒核心标记技术，清晰地揭示了 LEN 和 PF74 对 HIV-1 衣壳的作用机制。在体外实验中，LEN 稳定衣壳晶格的同时会导致核心完整性丧失，而 PF74 则会使衣壳晶格和核心完整性都显著受损。通过荧光成像和电子显微镜等实验，研究人员还发现，即使一些用 LEN 处理后的衣壳在电子显微镜下看似完整，但实际上可能存在微小的孔洞或破裂，这凸显了 cmGFP 在评估病毒核心完整性方面的重要价值。
在细胞实验中，LEN 处理会使核内的 cmGFP 病毒核心迅速消失，但 GFP-CA 病毒核心消失较少，这进一步证实了 LEN 破坏核心完整性却稳定衣壳晶格的特性。而且，LEN 抑制核输入的效果与浓度有关，较低浓度就能有效抑制核输入，这表明 LEN 诱导的衣壳晶格变化足以阻止病毒核心进入细胞核。相比之下，PF74 则通过抑制病毒核心与核膜的结合来阻止核输入。
与以往研究相比，本研究不仅直接测量了衣壳稳定性，还在感染细胞中直接量化了核心完整性的丧失和衣壳晶格的稳定情况。同时，研究结果也与之前关于 GFP-CA 位置的研究结论不同，明确了 GFP-CA 是整合到衣壳晶格中的。
从临床应用角度来看，LEN 已获批用于治疗多重耐药的 HIV-1 感染，其在体内能维持较高的血浆浓度，足以破坏 HIV-1 核心，阻止其核输入，从而降低病毒的感染性。虽然病毒核心通过核孔复合物的具体机制尚不明确，但研究数据表明，破损的病毒核心虽能与核孔复合物结合，却无法完成进入细胞核的关键步骤。
总的来说，本研究深入揭示了 LEN 在体外和体内的作用机制，为理解衣壳靶向抗病毒药物提供了重要依据，也为开发新一代抗 HIV 治疗策略奠定了坚实基础。未来，随着对 HIV-1 感染机制和抗病毒药物研究的不断深入，有望开发出更有效的治疗方法，为全球抗击 HIV-1 感染带来新的希望。
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