### 草鱼呼肠孤病毒 II 型（GCRV-II）的研究背景
草鱼（
Ctenopharyngodon idella）在中国淡水养殖中占据重要地位，2022 年其产量高达 590 万吨，为渔业经济贡献显著。然而，草鱼呼肠孤病毒（GCRV）引发的草鱼出血病严重威胁着草鱼养殖业。GCRV 属于
Aquareovirus属、
Spinareoviridae科，依据基因组条带模式和序列差异可分为三个基因型，其中 GCRV-II 是中国流行的主要毒株。
GCRV-II 在不同宿主细胞中的感染表现独特，在 CIK 细胞中不引起细胞病变效应（CPE），但却能导致一岁鱼超过 80% 的死亡率，相比之下，I 型和 III 型 GCRV 在 CIK 细胞中会引发明显的 CPE，在草鱼中仅诱导轻度出血性疾病和较低死亡率，这些差异背后的机制尚不明确。
在病毒复制和组装方面，Spinareoviridae科病毒通常在细胞质内的病毒质（viroplasm）中进行，病毒质是包含宿主和病毒成分的无膜结构，对病毒形态发生至关重要。已有研究表明，部分呼肠孤病毒的病毒质具有液滴样特性，通过液 - 液相分离（LLPS）形成，且这种特性对病毒的基因组复制、病毒粒子组装以及逃避宿主免疫具有重要意义。然而，作为中国主要流行的 GCRV-II，其病毒质的形成机制以及在感染过程中的具体作用仍不清楚，探究这些问题对了解 GCRV-II 的致病机制、防控该病毒感染具有重要意义。
GCRV-II 感染诱导病毒质形成
为研究 GCRV-II 感染过程中病毒质的形成情况，研究人员对感染 GCRV-II 的草鱼进行实验。免疫荧光分析显示，在感染鱼的肾脏和肠道样本细胞质中，可观察到球状或点状结构，这些结构与其他呼肠孤病毒感染细胞后形成的病毒质相似，而在未感染的对照鱼样本中则未出现。体外实验中，用 GCRV-II 感染 GCO 细胞，同样在细胞质中观察到类似结构。
研究还发现，非结构蛋白 NS38 在 GCRV-II 感染时会形成类似病毒质的结构（VLSs）。当转染 EGFP 或 mCherry 标记的 NS38 质粒到 GCO 细胞后，在无 GCRV-II 感染时，NS38 均匀分布在细胞质中；感染后，则形成球状结构。这些结果有力地证明了 GCRV-II 感染能够诱导病毒质的形成。
NS79 负责 GCRV-II 病毒质的形成
在探究负责 GCRV-II 病毒质形成的蛋白时，研究人员关注到非结构蛋白 NS79，它是 GCRV-I 中 NS80 以及哺乳动物呼肠孤病毒（MRV）和禽呼肠孤病毒（ARV）中 σNS 的同源蛋白，后两者是病毒质形成的关键蛋白。
实验中，将 EGFP 标记的病毒蛋白转染到细胞内，发现 NS79-EGFP 在体外能形成类似病毒质的球状包含结构（VLSs）。而其他蛋白，如 VP4-EGFP 和 VP41-EGFP 则在细胞核周边形成不规则聚集结构，其余蛋白均匀分布在细胞质或整个细胞中。
进一步将 NS79-EGFP 与其他 mCherry 标记的病毒蛋白共转染，通过共聚焦显微镜观察发现，除 VP4 和 VP41 外，大多数蛋白都能与 NS79-EGFP 形成的 VLSs 共聚集。综合这些结果，可以确定 NS79 是负责 GCRV-II 病毒质形成的关键蛋白。
GCRV-II 病毒质缺乏液滴样特性
以往研究表明，呼肠孤病毒的病毒质具有高度动态的液滴样特性。为探究 GCRV-II 病毒质是否具有类似性质，研究人员进行了一系列实验。
以 NS38 为 GCRV-II 病毒质的标记，通过活细胞成像观察发现，在感染后 6 小时和 12 小时，GCRV-II 病毒质在 15 分钟内未发生融合和分裂事件，而作为对照的 GCRV-I 病毒质在相同时间点分别发生了两次和四次融合事件。
荧光漂白恢复（FRAP）实验结果显示，GCRV-I 病毒质在漂白后 15 秒内荧光信号迅速恢复，不到 1 分钟就能恢复到接近原始强度的 100%，而 GCRV-II 病毒质在 5 分钟内荧光信号恢复不超过初始强度的 40%。
用 4% 的 1,6 - 己二醇（1,6-HD）处理感染细胞，1,6-HD 通常用于溶解通过 LLPS 形成的组装体。结果发现，GCRV-II 病毒质的荧光信号在处理后 10 多分钟不受影响，而 GCRV-I 病毒质的荧光信号在处理 10 分钟后显著降低甚至几乎完全消失。
此外，对负责 GCRV-II 病毒质形成的 NS79 进行研究，发现其也不具备 LLPS 特性。综合这些实验结果，充分证明 GCRV-II 病毒质缺乏液滴样特性。
GCRV-II 病毒质是膜结合结构
传统认知中，呼肠孤病毒的病毒质是无膜结构，这与它们的液滴样特性密切相关。但 GCRV-II 病毒质是否也是无膜结构尚不清楚。
透射电子显微镜（TEM）分析显示，GCRV-II 病毒质被膜清晰包裹，内部的病毒粒子排列有序，同时还发现一些细胞质成分或细胞器也被包裹在膜内。而 GCRV-I 病毒质则是无膜结构，与其他膜结合的细胞器明显不同，且内部没有细胞质成分或细胞器。
进一步通过免疫荧光实验验证，用 Triton X-100 或洋地黄皂苷（digitonin）处理感染细胞，Triton X-100 可通透细胞膜和内部膜，digitonin 仅通透细胞膜而不通透细胞内膜。结果显示，GCRV-I 病毒质在两种处理方式下都能被检测到，而 GCRV-II 病毒质仅在 Triton X-100 处理的细胞中可见，在 digitonin 处理的细胞中难以检测到。这些结果有力地证实了 GCRV-II 病毒质是膜结合结构，与 GCRV-I 病毒质有显著区别。
GCRV-II 感染诱导自噬和自噬小体形成
鉴于 GCRV-II 病毒质被膜包裹，且内部含有病毒粒子和细胞质成分或细胞器，这些特征与自噬小体相似，研究人员推测 GCRV-II 感染可能诱导自噬和自噬小体形成。
实验结果显示，感染 GCRV-II 的草鱼，其肠道和肾脏样本中多个自噬相关基因（ATG5、ATG10、ATG12、LC3B、Beclin-1 和 P62）的表达水平显著高于对照鱼。免疫荧光实验中，LC3B 在感染鱼样本中呈现点状分布，而在对照鱼中均匀分布。转染 EGFP 或 mCherry 标记的 LC3B 到 GCO 细胞后，感染 GCRV-II 的细胞中，LC3B 荧光也呈现点状，而未感染细胞中则均匀分布。TEM 分析发现，感染鱼的肾脏样本中有大量自噬小体样囊泡，且许多 GCRV 病毒粒子被这些囊泡包裹，对照鱼样本中则很难检测到。定量分析表明，感染组中 LC3B 点状结构和自噬小体样囊泡的数量明显高于对照组。这些结果表明 GCRV-II 感染能够诱导自噬和自噬小体形成。
同时，研究人员还对自噬通量进行了研究。自噬适配器 SQSTM1/p62 是评估自噬通量的指标，它能靶向特定货物进行自噬，并通过自噬 - 溶酶体途径特异性降解。Western blotting 分析显示，GCRV-II 感染后，LC3B-II 蛋白水平显著增加，表明自噬被激活，但 p62 蛋白水平并未下降，且溶酶体相关膜蛋白 2（Lamp2）的表达水平也未增加。利用 pCMV-mCherry-GFP-LC3B 质粒检测自噬通量，发现感染 GCRV-II 的细胞中，GFP 和 mCherry 点状信号都能观察到，这表明自噬体与溶酶体的融合被阻断，即自噬通量受到抑制。
GCRV-II 利用自噬小体进行病毒质形成和病毒粒子组装
为探究 GCRV-II 是否利用病毒诱导的自噬小体进行病毒质形成和病毒粒子组装，研究人员进行了免疫荧光和免疫电镜实验。
免疫荧光实验中，用 LC3B 和 GCRV-II 的 NS79、VP4 或 dsRNA 抗体进行检测，结果显示 NS79、VP4 或 dsRNA 抗体标记的病毒质与 LC3B 标记的自噬小体明显共定位。将 NS38-EGFP 与 LC3B-mCherry 共转染到 GCO 细胞后，感染 GCRV-II 时，NS38-EGFP 形成的 VLSs 与 LC3B-mCherry 标记的自噬小体共聚集。
免疫电镜实验进一步证实，感染 GCRV-II 的肾脏样本中，含有病毒粒子的膜性囊泡能被 LC3B 抗体特异性标记，表明这些囊泡就是自噬小体。同时，这些囊泡还能与 GCRV-II 的 VP4 抗体和 dsRNA 抗体发生反应，说明 GCRV-II 在自噬小体中进行复制和组装。而对照肾脏样本与这些抗体均无反应。综合这些结果，表明 GCRV-II 利用自噬小体进行病毒质形成和病毒粒子组装。
GCRV-II 利用自噬小体建立亚临床持续感染
先前研究表明 GCRV-II 能在草鱼脑组织中建立亚临床持续感染（又称潜伏感染）。为深入探究其分子机制，研究人员收集了有或无 GCRV 暴露史的草鱼，对其肾脏和脑组织进行分析。
RT-PCR 检测发现，有 GCRV-II 暴露史的部分鱼体内能扩增出特异性病毒条带，而无暴露史的鱼则没有，这表明存在亚临床持续的 GCRV-II 感染。从外观上看，亚临床持续感染鱼和对照鱼体表均无出血症状，肾脏组织学切片分析也未发现明显病理变化，但感染鱼的脑组织出现了如脑基质疏松和细胞坏死等病理变化。
TEM 分析显示，亚临床持续感染鱼的脑组织中有大量 GCRV-II 病毒粒子，且这些病毒粒子被自噬小体样囊泡包裹，对照鱼脑组织中则未发现病毒粒子。进一步分析干扰素相关基因的表达水平，发现感染鱼和未暴露鱼之间，干扰素调节因子（IRF3 和 IRF7）以及干扰素（IFN1 和 IFN3）的 mRNA 表达水平和 IRF3、IRF7 的蛋白表达水平均无显著差异。这些结果强烈表明，GCRV-II 利用自噬小体建立亚临床持续感染，并逃避宿主免疫系统。
GCRV-II 利用自噬小体进行非裂解性释放和传播
研究人员发现，GCRV-I 感染 CIK 细胞会诱导明显的 CPE，而 GCRV-II 感染则不会。RT-PCR 检测证实 GCRV-II 成功感染了细胞，收集 GCRV-II 感染细胞的上清液感染草鱼，导致超过 70% 的鱼死亡并出现典型出血症状，而对照上清液则无此现象，这表明 GCRV-II 感染细胞后存在非裂解性释放子代病毒的情况。
为研究自噬在 GCRV-II 非裂解性释放中的作用，用自噬诱导剂雷帕霉素（Rapa）或自噬抑制剂 3 - 甲基腺嘌呤（3-MA）处理感染细胞，结果发现 Rapa 处理增加了上清液中 GCRV-II 的拷贝数，3-MA 处理则相反，但两种处理均未促进细胞病变效应。
TEM 分析感染不同时间点的细胞和鱼肾脏样本发现，含有病毒粒子的自噬小体出现在细胞膜周边、与细胞膜融合或位于细胞外，在肾脏细胞间的连接区域也能观察到。这表明 GCRV-II 可能利用自噬小体作为载体，克服细胞膜屏障，实现非裂解性释放和病毒传播，这也可能是其在培养细胞中不诱导 CPE 的主要原因。
研究结论
本研究全面揭示了 GCRV-II 病毒质的形成机制及其在感染过程中的功能。GCRV-II 感染诱导形成的病毒质为膜性结构，缺乏液滴样特性，病毒质形成和病毒粒子组装发生在其诱导的自噬小体中。此外，GCRV-II 还利用自噬小体进行亚临床持续感染、非裂解性释放和病毒传播。这些发现表明 GCRV-II 的感染机制与 GCRV-I 及其他动物呼肠孤病毒不同，为防控该病毒提供了重要的理论依据，有助于开发更有效的防治策略，保护草鱼养殖业的健康发展。
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