新发现！疟原虫微线体蛋白 PvMP38：疟疾干预的潜在关键靶点

时间：2025年4月10日

来源：mBio

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本文聚焦疟原虫研究。因间日疟原虫（P. vivax）缺乏体外培养系统，研究借助诺氏疟原虫（P. knowlesi）模型。发现新微线体蛋白 PvMP38，它与 Pv12、Pv41 形成复合物参与红细胞入侵，为疟疾干预和疫苗开发提供新方向。

一、研究背景

在感染人类的五种疟原虫中，间日疟原虫（P. vivax）是导致发病的重要原因，尤其在东南亚地区。多数与间日疟原虫相关的死亡发生在无性血液阶段，因此开发针对该阶段的疫苗至关重要。然而，目前疫苗研发面临诸多挑战。
间日疟原虫仅侵袭网织红细胞，这限制了其体外连续培养；膜结合蛋白难以以可溶形式表达；检测低亲和力蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）的灵敏度有限，这些都阻碍了新的血液阶段疫苗候选物的探索。
诺氏疟原虫（P. knowlesi）是一种与人疟原虫有密切亲缘关系且抗原具有交叉反应性的人畜共患寄生虫。与间日疟原虫不同，它可在人红细胞中体外培养，且 CRISPR - Cas9 基因组修饰技术在诺氏疟原虫中的应用，使其成为研究间日疟原虫入侵机制和验证疫苗候选物的理想替代模型。
此前对间日疟原虫胞外域文库的高通量分析，发现了包括 Pv12 - Pv41 和 Pv12 - PVX_110945（本研究中确定为 PvMP38）等重要分子相互作用，预测它们在血液阶段寄生虫中发挥关键作用。本研究首次对 PvMP38 进行功能表征，探究其在疟原虫入侵机制中的作用。

二、研究结果

全长胞外域蛋白表达和多克隆抗体制备
为研究蛋白功能并建立间日疟原虫的 PPI 系统，构建了重组蛋白。PvMP38 与诺氏疟原虫的同源蛋白有 55.5% 的序列一致性，且在其他疟原虫物种中高度保守。SDS - PAGE 和 BN - PAGE 分析显示，重组 PvMP38 蛋白在变性条件下呈现约 35、43 和 63kDa 三条带，经 LC - MS 分析确认；在天然条件下，其迁移大小约为 150kDa，大于预测的单体分子量 38kDa，表明发生了寡聚化。同时制备了针对 PvMP38 的动物免疫血清，并通过免疫印迹验证了其特异性。此外，还表达了带有 His 或 Fc 标签的 Pv12 和 Pv41 蛋白，用于后续实验。
体外 PPI 鉴定
通过 ELISA 和生物层干涉技术（BLI）检测蛋白间相互作用。ELISA 检测到 Pv12 与 Pv41、Pv12 - Fc 与 PvMP38 - His 之间存在特异性相互作用，但未检测到 Pv41 与 PvMP38 的相互作用。BLI 结果显示，PvMP38 与 Pv12 - Fc 具有很强的结合力，解离常数（K_D）为 2.46 ± 0.12nM，而与 Pv41 - Fc 无明显相互作用。Pv12 - Fc 与 Pv41 的结合亲和力在不同方向上有所差异，表明 Pv12 虽与 Pv41 和 PvMP38 都有相互作用，但 Pv41 与 PvMP38 之间不存在结合。实验还验证了系统的特异性，证实了种间结合的兼容性，即诺氏疟原虫的 P12 可与 PvMP38 和 Pv41 相互作用。
PvMP38 的亚细胞定位
利用抗重组 PvMP38 抗体探究其在寄生虫中的定位。结果显示，PvMP38 与微线体 DBP 共定位，与棒状体蛋白 RAMA、棒状体颈部蛋白 RON2 和表面蛋白 MSP1 定位不同，表明其定位于微线体。在间日疟原虫和诺氏疟原虫中，PvMP38 的定位相似，且与 Pv12 位于相邻的顶端位点。E64 处理可阻断虫体逸出但不影响顶端细胞器的分泌，处理后 PvMP38 和 Pv12 均分泌到裂殖子表面并共定位。
pkmp38 缺失对诺氏疟原虫血液阶段入侵效率和生长的影响
通过 CRISPR - Cas9 技术敲除诺氏疟原虫中的pkmp38基因，该基因是pvmp38的直系同源基因。基因敲除成功后，通过基因分型和免疫荧光、免疫印迹实验验证了pkmp38基因的缺失和 PvMP38 蛋白的不表达。生长抑制实验表明，敲除pkmp38基因的诺氏疟原虫在初始 10 个复制周期内，生长速率和复制效率显著低于野生型，但约 15 个复制周期后生长速率有所恢复，说明pkmp38在血液阶段寄生虫的生长和入侵中起关键作用，且诺氏疟原虫在缺乏 PvMP38 同源物表达时可采用替代途径入侵红细胞。
Pv12、Pv41 和 PvMP38 之间的 PPI
利用野生型和敲除型诺氏疟原虫裂殖体丰富的裂解物进行共免疫沉淀实验，验证 Pv12、Pv41 和 PvMP38 之间的相互作用。结果表明，在野生型寄生虫中，抗 Pv12 和抗 PvMP38 抗体可成功共免疫沉淀 Pv41 + PvMP38 和 Pv12 + Pv41 的同源物，抗 Pv41 抗体可拉下 Pv12 和 Pv41，但可能由于亲和力低或空间位阻无法拉下 PvMP38。在敲除型寄生虫中，只能检测到 Pv12 和 Pv41 条带，为三者形成复合物提供了证据，也突出了这些抗原中存在保守的种间特异性表位。
PvMP38 的免疫反应性和抗原表位特异性
利用蛋白质微阵列评估疟疾患者对 PvMP38 的免疫反应。在间日疟原虫感染样本（n = 72）中，IgG 阳性率为 51.4%；在诺氏疟原虫感染样本（n = 56）中，IgG 反应率为 41.1%。对天然和热处理的抗原进行比较，发现 PvMP38 主要针对线性化抗原表位。热处理后，间日疟原虫患者血清中对 PvMP38 的免疫反应显著增加，血清反应性从 51.4% 上升到 70.8%，诺氏疟原虫样本也有适度增加，表明 PvMP38 在间日疟原虫和诺氏疟原虫感染中具有免疫原性和线性抗原表位特异性。
联合抗体对诺氏疟原虫裂殖子入侵的抑制作用
评估针对 PvMP38、Pv12 和 Pv41 的单克隆抗体及组合抗体对野生型和敲除型诺氏疟原虫的入侵抑制效果。单克隆 PvMP38 抗体对野生型诺氏疟原虫裂殖子入侵具有剂量依赖性抑制作用，在 4mg/mL 时抑制率可达 51.55% ± 1.25%，在敲除型中显著降低至 29.08% ± 2.15%。抗 Pv12 抗体单独使用时抑制率低于 50%，但与其他抗体联合使用时抑制效果显著增强。双抗体组合中，抗 Pv41 和抗 PvMP38 抗体组合（各 2mg/mL）抑制率为 63.22% ± 2.01% ，与抗 Pv12 加抗 PvMP38 抗体组合效果相当。三抗体组合（Pv12、Pv41 和 PvMP38 各 1.3mg/mL）抑制率最高，可达 73.95% ± 1.91%，超过了单个抗体在 4mg/mL 时的抑制效果，表明存在加性抑制作用。在敲除型寄生虫中，含抗 PvMP38 抗体的鸡尾酒组合抑制效率降低，而 Pv12 + Pv41 组合仍有效，证实了观察到的加性效应是针对 Pv12 - Pv41 - PvMP38 复合物的特异性效应。

三、研究讨论

与恶性疟原虫相比，由于缺乏连续的体外培养系统，在间日疟原虫入侵过程中被描述的抗原较少。此前虽已确定了一些间日疟原虫入侵相关的分子相互作用，但许多蛋白，包括 PvMP38，特征仍不明确。
本研究借助改进的重组蛋白质量和诺氏疟原虫的基因修饰技术，对 PvMP38 进行了功能表征。通过在蛋白结合伙伴上使用基因工程 IgG Fc 结构域标签，增强了分子间相互作用的亲和力，检测到了 Pv12/Pk12 - PvMP38 的高亲和力相互作用。免疫荧光和共免疫沉淀实验表明，PvMP38 与 Pv12、Pv41 可能在疟原虫入侵过程中形成复合物，但目前尚无该蛋白复合物的结构配置证据，需进一步研究。
LC - MS 分析显示 PvMP38 存在截断形式或结构异构体，热处理实验表明其主要针对线性抗原表位，这有助于区分保护性和构象性抗原表位，对疫苗候选物的鉴定具有重要意义。
首次证实 PvMP38 与 Pv12、Pv41 在不同物种间形成保守的 PPI 或蛋白复合物，利用诺氏疟原虫作为间日疟原虫的替代模型评估了抗体功效和基因可操作性，但该模型也存在局限性，需结合多种模型更精确地表征间日疟原虫抗原。
基因敲除实验表明，pkmp38基因缺失虽最初阻碍了诺氏疟原虫的入侵和生长，但寄生虫可通过替代入侵分子进行补偿。单一候选疫苗易被免疫系统逃避，本研究中三抗体联合对 PvMP38、Pv12 和 Pv41 的加性抑制效应，为多抗原疫苗的开发提供了思路，有助于提高对疟疾的免疫反应和保护效果。本研究发现的 PvMP38 及其与 Pv12、Pv41 的相互作用，为间日疟原虫网织红细胞入侵机制提供了新见解，为疟疾疫苗开发开辟了新途径。