插入序列介导的噬菌体抗性对溶细胞性粪肠球菌肠道定植减弱的影响及临床意义

时间：2025年4月16日

来源：Microbiology Spectrum

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本文研究了溶细胞性粪肠球菌（E. faecalis）临床分离株的噬菌体抗性。分离出的抗性变体获得了与肠球菌多糖抗原（Epa）生物合成相关基因的突变或缺失，在肠道定植能力减弱。这为噬菌体治疗酒精相关性肝炎提供了新的思路，具有重要意义。

引言

酒精相关性肝炎是酒精相关肝病中最为严重的类型，其死亡率在 1 - 6 个月内可达 20% - 40%。研究发现，粪便中溶细胞性粪肠球菌与酒精相关性肝炎的严重程度密切相关，89% 溶细胞素阳性的患者在入院 180 天内死亡，而阴性患者死亡率仅 3.8%，因此，特异性清除肠道微生物群中的溶细胞性粪肠球菌可能是治疗酒精相关性肝炎的关键。

噬菌体是一类能特异性感染并杀死细菌的病毒。在抗菌药物耐药菌不断出现的背景下，噬菌体疗法受到广泛关注。它能精准编辑肠道微生物群，且对有益菌影响较小。此前研究表明，针对特定细菌的噬菌体可在多种疾病模型中精准编辑肠道微生物群并减轻疾病进展，例如针对肺炎克雷伯菌的噬菌体在炎症性肠病、原发性硬化性胆管炎和非酒精性脂肪肝病模型中的应用，以及针对溶细胞性粪肠球菌的噬菌体可消除人源化小鼠的乙醇诱导性肝病。

肠球菌多糖抗原（Epa）在粪肠球菌与宿主的多种相互作用中发挥关键作用，包括黏附到肠道黏液、抵抗胆汁盐以及作为噬菌体的主要受体介导感染。参与 Epa 生物合成的基因产物由一个 40.6 kb 的基因座编码，该基因座是获得噬菌体抗性的突变热点。例如，epaR 突变可导致对噬菌体 NPV1 的抗性，galE 突变可引发对噬菌体 vB_EfaS_efap05 - 1 的抗性。

插入序列 IS256 广泛存在于耐多药葡萄球菌和肠球菌基因组中，由 1324 个碱基对组成，编码转座酶蛋白。它可作为同源重组的交叉点，促进基因组的灵活性、适应性和进化，还参与了粪肠球菌 V583 株对噬菌体的抗性。尽管噬菌体疗法前景广阔，但噬菌体抗性变体的出现是其发展面临的问题。不过，近期关于噬菌体抗性所带来的适应性权衡的研究为噬菌体疗法开辟了新途径。本研究旨在分离溶细胞性粪肠球菌临床分离株的噬菌体抗性变体，并评估其特性，为酒精相关性肝炎的治疗提供依据。

结果

溶细胞性粪肠球菌噬菌体抗性变体的分离：将溶细胞性粪肠球菌临床分离株 EF01 分别与 ΦEf2.1 和 ΦEf2.2 共培养 5 天，在第 5 天从感染培养物中分离出四个噬菌体逃逸突变株，分别命名为 R - EF01^ΦEf2.1 - A、R - EF01^ΦEf2.1 - B、R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B。与未感染的野生型（WT）EF01 和感染 ΦEf2.1 后分离的菌株相比，感染 ΦEf2.2 后分离的 R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 菌株存在生长缺陷。进一步检测噬菌体对各突变株的感染效率（EoP）发现，R - EF01^ΦEf2.1 - A 和 R - EF01^ΦEf2.1 - B 对 ΦEf2.1 表现出部分抗性，而 R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 对 ΦEf2.1 和 ΦEf2.2 均具有抗性，且传代后抗性稳定。
噬菌体抗性宿主变体的基因组突变：对 EF01 WT 和四个噬菌体抗性变体进行全基因组测序。在 R - EF01^ΦEf2.1 - A 和 R - EF01^ΦEf2.1 - B 中未检测到已知与噬菌体感染相关基因的单核苷酸变异（SNV），但在 xylA 基因中发现了转座子 IS256 的插入。在 R - EF01^ΦEf2.2 - A 中鉴定出一个细菌糖基转移酶 epaR 的非同义突变，R - EF01^ΦEf2.2 - B 中未发现已知与噬菌体抗性相关的突变。此外，R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 基因组存在零覆盖区域，提示有缺失事件。通过长读长扩增子测序确定，R - EF01^ΦEf2.2 - A 存在 99333 bp 的染色体缺失，R - EF01^ΦEf2.2 - B 存在 98267 bp 的染色体缺失，且两个菌株均缺失了包括 galE 在内的 117 个编码序列（CDS）。galE 的缺失通过 PCR 分析得到证实，其缺失会导致 Epa 结构缩短和不完整，去除噬菌体结合位点。检测发现，R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 的 Epa 生物合成存在缺陷，噬菌体对其吸附率显著降低，而对 R - EF01^ΦEf2.1 - A 和 R - EF01^ΦEf2.1 - B 的吸附率与 WT 相当。同时，ΦEf2.1 在 R - EF01^ΦEf2.1 - A 和 R - EF01^ΦEf2.1 - B 中无基因组复制活性，表明这两个菌株具有与 xylA 相关的细胞内噬菌体抗性机制，且独立于细菌表面分子（如作为噬菌体受体的 Epa）的变化。
噬菌体抗性变体在肠道中的定植：由于 Epa 在肠道定植中起重要作用，推测噬菌体抗性变体的细菌表面结构变化会减弱其在肠道的定植能力。将携带壮观霉素（Spc）抗性基因和毒素 - 抗毒素系统（txe 和 axe）的质粒 pSL101P_16S导入粪肠球菌菌株，构建标记菌株。结果显示，标记后的 EF01 WT 和噬菌体抗性变体在 BHI - Spc 琼脂平板上表现出 Spc 抗性和相似的菌落形成活性，且质粒在细胞中至少能稳定维持 5 天。将这些标记菌株灌胃给 C57/BL6 小鼠，收集粪便样本检测发现，R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 在粪便中的活菌数在 48 h 和 72 h 显著低于 WT，且 72 h 时，R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 灌胃组粪便中溶细胞素阳性小鼠的比例也显著降低，表明噬菌体抗性相关的细菌表面结构变化（可能包括 Epa 生物合成缺陷）会导致肠道定植减弱。
噬菌体抗性变体对上皮细胞黏附减少和对胆汁盐敏感性增加：评估 EF01 WT 和噬菌体抗性变体对人上皮细胞的黏附能力和对胆汁盐的抗性。结果显示，R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 对 Caco2 细胞的黏附能力显著低于 EF01 WT 和 R - EF01^ΦEf2.1 - A。在胆汁盐抗性方面，EF01 WT 和 R - EF01^ΦEf2.1 - A 对脱氧胆酸钠具有抗性，而 R - EF01^ΦEf2.2 - A 的活力在 0.08% 脱氧胆酸钠处理下显著降低，R - EF01^ΦEf2.2 - B 对脱氧胆酸钠更为敏感，在较低浓度（0.04%、0.06% 和 0.08%）下就表现出显著差异。

讨论

所有粪肠球菌菌株都产生 Epa，它是宿主 - 病原体相互作用中肠道定植的关键多糖。本研究中，通过 epaR 和 galE 基因功能障碍获得噬菌体抗性导致 Epa 变化，进而减弱了溶细胞性粪肠球菌变体在肠道的定植。同时，EF01 中 Epa 缺陷引起的细菌表面结构变化导致黏附活性和胆汁盐抗性减弱，这是肠道定植减弱的关键因素。尽管 R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 具有相似的染色体缺失区域，但 R - EF01^ΦEf2.2 - B 的肠道定植率和胆汁盐抗性明显低于 R - EF01^ΦEf2.2 - A，推测可能与 R - EF01^ΦEf2.2 - B 中缺失的 YibE/F（一种假定的膜蛋白）有关。此外，R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 在粪便中的阳性样本数显著减少，可能还与其增殖潜力下降有关。这些结果表明，溶细胞性粪肠球菌在获得噬菌体抗性的同时，以降低肠道定植能力为代价，这种 “权衡” 为噬菌体治疗酒精相关性肝炎提供了有利的治疗策略。

细菌的荚膜多糖（CPS）和 / 或胞外多糖（EPS）可增强细菌对宿主细胞的黏附和定植效率，同时也是某些噬菌体的主要受体。本研究表明 Epa 是溶细胞性粪肠球菌菌株的假定噬菌体受体之一，利用这些噬菌体诱导多糖生物合成突变，即使出现噬菌体抗性，也可能促进肠道中特定病原体的定植减弱并被清除。此外，噬菌体抗性还可能使细菌对抗生素重新敏感，如 Epa 突变菌株在获得噬菌体抗性的同时，对细胞壁靶向抗生素（如万古霉素）敏感，这有助于防止其在抗生素治疗期间过度生长。相比之下，本研究中减少肠道定植的噬菌体抗性在防止对肠道微生物组的附带损害方面意义更大。

细菌通过破坏噬菌体感染周期获得噬菌体抗性，许多突变发生在噬菌体吸附步骤，尤其是噬菌体受体。在本研究中，针对 ΦEf2.2 的噬菌体抗性变体（EF01 R - EF01^ΦEf2.2 - A）中检测到 epaR 突变，这与之前报道的噬菌体抗性菌株中 epa 基因簇的突变积累一致。而 R - EF01^ΦEf2.1 - A 和 R - EF01^ΦEf2.1 - B 在噬菌体感染受体上无基因组变化，且对 ΦEf2.1 的吸附率与 WT 相当，但抑制了 ΦEf2.1 感染周期的吸附后步骤，可能是由于 IS256 插入 xylA 影响了噬菌体基因组的复制效率，但具体机制尚不清楚。

IS256 在多种选择压力下介导细菌进化。在本研究中，IS256 插入 R - EF01^ΦEf2.1 - A 和 R - EF01^ΦEf2.1 - B 的 xylA 基因，可能破坏了噬菌体感染相关的基因功能；在 R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 中，IS256 参与了染色体缺失。这些结果表明 IS256 可能通过破坏特定基因或引起染色体缺失参与溶细胞性粪肠球菌菌株的噬菌体抗性获得，支持了 IS256 促进粪肠球菌在噬菌体压力下适应的模型。研究还发现，选择能引起细菌表面结构（如 Epa）变化的特定噬菌体抗性，可能会带来有利的适应性权衡结果。此外，染色体缺失影响多个基因可能对病原体产生更显著的负面影响，因此深入了解 ΦEf2.2 通过 IS256 介导的机制诱导染色体缺失，有助于选择更适合临床应用的噬菌体，即使在治疗过程中出现噬菌体抗性，也可能获得更有利的临床结果。从这个角度来看，针对溶细胞性粪肠球菌治疗酒精相关性肝炎，应用 ΦEF2.2 可能比单独使用 ΦEF2.1 更具优势。不过，本研究存在局限性，R - EF01^ΦEf2.2 - A 和 R - EF01^ΦEf2.2 - B 的基因组变化复杂，涉及多个基因同时缺失，未来需要通过单个基因敲除菌株进行反向遗传验证，进一步明确每个缺失基因的具体作用及其与噬菌体抗性和肠道定植的因果关系。

综上所述，IS256 在溶细胞性粪肠球菌临床分离株的噬菌体抗性中起重要作用，噬菌体抗性变体通过改变细菌表面结构获得抗性的同时，可能会付出肠道定植能力下降的代价。这些发现为快速消除噬菌体抗性变体提供了潜在策略，有助于在噬菌体治疗酒精相关性肝炎中，即使存在噬菌体抗性，也能促进获得有利的临床结果。

材料和方法

粪肠球菌菌株和噬菌体：本研究使用从酒精相关性肝炎患者中获得的粪肠球菌临床分离株 EF01，以及先前从美国加利福尼亚州圣地亚哥污水处理厂污水中分离的噬菌体 ΦEf2.1（具有肌尾噬菌体结构）和 ΦEf2.2（具有短尾噬菌体结构）。
噬菌体的制备：采用液体培养法对噬菌体进行增殖，用于后续实验。
噬菌体抗性 EF01 菌株的分离：通过改良的液体选择法分离噬菌体抗性 EF01 变体。将 EF01 过夜培养物与噬菌体按感染复数（MOI）为 0.01 混合，在 37°C、150 rpm 振荡条件下共培养 24 h，然后传代培养 5 次。最后从培养物中挑取单菌落，经多次纯化得到克隆分离株。
EoP 测定：采用平板效率（EoP）法测定噬菌体的感染性。
全基因组测序：使用 MiSeq（Illumina）和 MinION（Oxford Nanopore Technologies）对粪肠球菌菌株进行全基因组测序。将亲本菌株的测序数据组装成完整的参考基因组，用于比对噬菌体抗性变体的 Illumina 测序数据。通过多种软件进行基因组注释、比较基因组分析，检测单核苷酸变异（SNV）、插入缺失（Indels）和插入序列。
聚合酶链反应：从粪肠球菌过夜培养物中提取 DNA，使用 Platinum II Hot - Start PCR Mix 进行聚合酶链反应（PCR）。
Epa 提取和染色：对先前的方法进行改良，提取 Epa 并通过阿尔辛蓝染色和凝胶电泳进行观察。
噬菌体吸附试验：按照先前报道的方法测定噬菌体对粪肠球菌菌株的吸附率。
EF01 菌株的转化：通过电穿孔法将携带 Spc 抗性基因和毒素 - 抗毒素系统的质粒 pSL101P_16S导入粪肠球菌菌株。
EF01 菌株定植活性的评估：将携带 pSL101P_16S的 EF01 WT 和噬菌体抗性变体培养至对数生长期后灌胃给 C57/BL6 小鼠，在 24 h、48 h 和 72 h 收集粪便样本，检测菌落形成活性，以评估其在肠道的定植能力。
通过 qPCR 检测溶细胞素：提取小鼠粪便样本的 DNA，使用 qPCR 检测溶细胞素小亚基（cylL_S）的存在。
粪肠球菌黏附试验：使用人结肠直肠上皮细胞系 Caco2 进行黏附试验。将 Caco2 细胞培养至汇合极化后，接种荧光标记的 EF01 WT 和噬菌体抗性变体，孵育后通过荧光显微镜观察并计数黏附的细菌数量。
统计分析：使用 Dunn 检验（基于单因素或方差分析）比较至少四个实验中的三个或更多组数据。对于百分比数据，使用双侧 Fisher 精确检验计算 P 值。P < 0.05 被认为具有统计学意义，使用 GraphPad Prism ver. 9.4.1 进行所有统计分析。

致谢

J.F. 得到了 Rakuno Gakuen 休假研究计划的支持。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）的多项资助，以及其他机构和奖项的支持。H.K. 得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的 Walter - Benjamin 奖学金支持。C.L. 也获得了多个基金和奖项的资助。此外，本研究还得到了日本学术振兴会（JSPS）等机构的资助。