线粒体功能障碍引发的代谢重编程促进 mTORC1 依赖的骨骼衰老：机制解析与潜在干预靶点

线粒体疾病患者常出现骨骼生长减缓等问题，其机制尚不明确。研究人员以软骨线粒体呼吸链（mtRC）功能受损的小鼠为模型，开展关于代谢适应对骨骼衰老影响的研究。结果发现 mtRC 功能障碍激活逆向三羧酸（TCA）循环，刺激 mTORC1 信号通路，加速骨骼衰老。该研究为靶向治疗线粒体疾病相关骨骼衰老提供理论依据。

在生命的奇妙旅程中，线粒体犹如细胞的 “能量工厂”，默默为细胞的各种活动提供能量。然而，当线粒体出现问题，一系列麻烦也随之而来。线粒体疾病作为一类罕见的遗传疾病，其主要特征是线粒体呼吸链（mtRC）功能下降。以往人们认为，线粒体疾病的临床症状主要源于能量消耗，却忽略了线粒体在生物合成过程中的重要作用。近年来的研究发现，线粒体疾病患者不仅存在能量代谢异常，还伴有蛋白质分泌紊乱、细胞衰老加速以及骨骼生长迟缓等问题，但其中的分子机制却如同迷雾，让科研人员难以捉摸。

为了揭开这层神秘的面纱，来自国外的研究人员展开了一项深入的研究。他们将目光聚焦在骨骼生长与线粒体功能的关系上。骨骼生长主要依赖于骨骺生长板软骨，这是一种神奇的组织，能在代谢挑战的环境下大量生成生物量。在早期发育阶段，它主要依靠糖酵解供能，出生后则逐渐激活线粒体呼吸。然而，当线粒体呼吸链功能受损时，会对骨骼发育产生怎样的影响呢？这成为了研究的关键问题。

研究人员选用了转基因小鼠模型，这些小鼠表达由 Col2a1 启动子驱动的突变线粒体解旋酶（Twinkle^K320E），导致 mtDNA 编码的对 mtRC 功能至关重要的基因失活。通过对这些小鼠的研究，研究人员发现，当 mtRC 功能受损时，小鼠的骨骼衰老进程明显加快，生长板软骨过早地转化为骨组织。这一现象背后隐藏着怎样的分子机制呢？

研究人员首先对小鼠的代谢情况进行了深入分析。他们利用液相色谱 - 质谱（LC - MS）分析技术，测定了 1 月龄小鼠股骨头软骨中糖酵解和三羧酸（TCA）循环代谢物的相对水平。结果发现，与正常小鼠相比，mtRC 功能受损的小鼠股骨头软骨中乳酸和其他糖酵解代谢物水平升高，同时 TCA 循环中间产物水平也有所上升。进一步的研究表明，TCA 循环的活性发生了逆转。研究人员通过¹³C₆葡萄糖示踪实验发现，在 mtRC 功能受损的软骨细胞中，葡萄糖衍生的碳原子更多地进入 TCA 循环的逆向片段，从丙酮酸到草酰乙酸再到琥珀酸，同时谷氨酰胺依赖的从 α - 酮戊二酸到柠檬酸的逆向碳富集也增加。这表明 TCA 循环的逆向激活是为了补充代谢物的损失，以维持细胞的生物合成需求。

TCA 循环的逆向激活对氨基酸代谢产生了重要影响。研究人员发现，mtRC 功能受损的软骨细胞中，甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和脯氨酸等氨基酸的从头合成增加。KEGG 通路富集分析也证实，“氨基酸生物合成” 相关的实体在 1 月龄 mtRC 功能受损小鼠股骨头软骨的蛋白质组数据中显著富集。这一系列结果表明，TCA 循环代谢物进入氨基酸生物合成途径，生成了独特的氨基酸谱，以支持骨骼生长所需的蛋白质合成反应。

氨基酸水平的变化又进一步影响了 mTORC1 信号通路。研究人员通过对 1 月龄小鼠股骨头软骨的磷酸化蛋白质组分析发现，mtRC 功能受损的小鼠中，mTORC1 信号通路的多个靶点磷酸化水平升高，包括胰岛素受体底物 1（pIRS^S302）和真核翻译起始因子 4E - 结合蛋白 1（p4E - BP1^S65、p4E - BP1^T70）等。免疫印迹分析也证实，下游 mTORC1 靶点核糖体 S6 激酶 β - 1（S6K1^T389）和 4E - BP1（4E - BP1^S65和 4E - BP1^T37/46）的磷酸化水平在 mtRC 功能受损的小鼠中明显升高。此外，研究人员还发现，氨基酸饥饿会导致 mTORC1 底物的磷酸化水平下降，但在 mtRC 功能受损的软骨细胞中，这种下降明显延迟，表明 mtRC 功能受损的软骨细胞中 mTORC1 信号通路持续激活。

mTORC1 信号通路的激活对细胞的生物合成过程产生了深远影响。研究人员通过非放射性表面翻译检测（SUnSET）分析和槽点杂交实验发现，mtRC 功能受损的小鼠股骨头软骨中蛋白质合成速率加快。同时，¹³C₆葡萄糖标记实验表明，TCA 循环的碳原子更多地进入嘧啶合成途径，促进了核苷酸的生物合成。在脂质代谢方面，mtRC 功能受损的小鼠股骨头软骨中多种脂肪酸亚类的含量增加，同时参与脂质合成的关键酶的表达也上调，导致脂质积累。

然而，mTORC1 的过度激活并非全是益处。研究发现，mTORC1 的过度激活会干扰自噬依赖的分泌途径。免疫荧光研究显示，在 mtRC 功能受损的小鼠股骨头软骨中，自噬相关蛋白 SQSTM1/p62 阳性的软骨细胞数量增加，表明自噬受到抑制。电子显微镜分析发现，mtRC 功能受损的软骨细胞中出现线粒体碎片化、内质网扩张和高尔基体紊乱等现象，这些都会影响细胞外基质（ECM）的分泌和组织，最终导致生长板软骨退化。

为了寻找改善 mtRC 功能受损导致的细胞死亡和软骨退化的方法，研究人员进行了一系列实验。他们发现，长期氨基酸饥饿会导致 mtRC 功能受损的软骨细胞死亡增加，而补充烟酰胺单核苷酸（NMN）可以显著降低细胞死亡率。这表明氧化还原失衡是恢复软骨细胞存活、预防软骨退化和过早衰老的关键靶点。

综上所述，该研究揭示了线粒体功能障碍引发的代谢重编程促进 mTORC1 依赖的骨骼衰老的分子机制。研究人员通过对小鼠模型的深入研究，发现 mtRC 功能障碍激活逆向 TCA 循环，刺激氨基酸生物合成，进而激活 mTORC1 信号通路。虽然这一代谢适应在短期内有助于维持细胞的生物合成功能，但长期来看，mTORC1 的过度激活会干扰自噬和 ECM 分泌，加速骨骼衰老。该研究为理解线粒体疾病相关的骨骼衰老机制提供了重要线索，同时也为开发针对线粒体疾病的治疗策略提供了潜在的靶点。研究人员表示，未来还需要进一步研究如何精准地调控这些代谢通路，以实现对线粒体疾病的有效治疗。

研究人员在开展此项研究时，主要运用了以下几种关键技术方法：选用转基因小鼠模型（通过特定基因编辑模拟线粒体功能障碍）；采用液相色谱 - 质谱（LC - MS）技术分析代谢物水平；运用¹³C 标记的葡萄糖和谷氨酰胺进行代谢示踪实验；利用质谱分析技术研究磷酸化蛋白质组；借助免疫印迹和免疫荧光等实验手段检测相关蛋白的表达和定位情况。

研究结果如下：

1. 骨骼衰老响应加速：通过监测转基因 CreTW 小鼠（软骨特异性 mtDNA 缺失）股骨头的生长板软骨退化过程，发现其衰老进程比正常小鼠明显加快，3 个月时就出现衰老迹象，而正常小鼠 6 个月才出现，且 4 个月时股骨头软骨就被骨组织完全替代。
2. TCA 循环酶和代谢物水平升高：对 1 月龄小鼠股骨头软骨进行 LC - MS 分析，发现 mtRC 功能受损的小鼠中，糖酵解代谢物（如乳酸、果糖 - 6 - 磷酸和丙酮酸）和 TCA 循环中间产物水平均升高，同时 TCA 循环中多数酶增加，线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）相关的部分蛋白质丰度下降，且软骨中 NAD⁺/NADH 比值降低，呈现还原微环境。
3. TCA 循环活性逆转：¹³C₆葡萄糖喂养实验表明，mtRC 功能受损的软骨细胞中，糖酵解过程受到刺激，同时 TCA 循环从草酰乙酸到琥珀酸的逆向片段被激活，¹³C₅谷氨酰胺喂养实验进一步证实了从 α - 酮戊二酸到柠檬酸的逆向碳富集增加，说明 TCA 循环逆向激活以补充代谢物。
4. 逆向 TCA 循环刺激氨基酸相关通路：碳标记实验和 LC - MS 分析发现，mtRC 功能受损的软骨细胞中氨基酸从头合成增加，KEGG 通路富集分析显示 “氨基酸生物合成” 相关实体显著富集，且多种参与氨基酸合成的酶水平升高，同时部分氨基酸在体内的稳态水平也增加。
5. 氨基酸水平扰动促进 mTORC1 信号传导：对 1 月龄小鼠股骨头软骨的磷酸化蛋白质组分析和免疫印迹实验表明，mtRC 功能受损会导致 mTORC1 信号通路激活，氨基酸饥饿实验进一步验证了 mtRC 功能受损的软骨细胞中 mTORC1 信号通路持续激活，且多种氨基酸混合可协同激活 mTORC1 信号通路。
6. mTORC1 依赖的下游生物合成机制被刺激：富集分析显示 mtRC 功能受损的小鼠体内 mRNA 翻译和核苷酸代谢相关术语显著富集，SUnSET 分析和免疫荧光研究表明蛋白质合成增加，¹³C₆葡萄糖标记实验证实核苷酸生物合成增加，同时脂质代谢分析发现 mtRC 功能受损的小鼠股骨头软骨中脂质积累增加。
7. mTORC1 过度激活干扰自噬依赖的分泌途径：免疫荧光研究和电子显微镜分析表明，mTORC1 过度激活会抑制自噬，导致软骨细胞中出现线粒体碎片化、内质网和高尔基体紊乱等现象，影响 ECM 的分泌和组织，进而导致生长板软骨退化。
8. 氧化还原失衡是关键靶点：长期氨基酸饥饿实验表明，mtRC 功能受损的软骨细胞在氨基酸缺乏时细胞死亡增加，而补充 NMN 可改善这一情况，说明氧化还原失衡是恢复软骨细胞存活、预防软骨退化和过早衰老的关键靶点。

研究结论和讨论部分指出，线粒体疾病患者出现的能量消耗增加、生长迟缓等现象与代谢重编程有关。在 mtRC 功能受损的情况下，TCA 循环逆向运行以维持代谢物供应，但长期来看无法完全恢复氧化还原和能量稳态。TCA 循环重编程刺激氨基酸生物合成和 mTORC1 信号传导，虽然在一定程度上维持了细胞的生物合成功能，但过度激活的 mTORC1 会干扰自噬，破坏 ECM 分泌和组织，最终导致生长板软骨退化和骨骼衰老加速。此外，氧化还原失衡是影响软骨细胞存活的关键因素，补充 NMN 等调节氧化还原平衡的方法具有改善线粒体功能障碍相关骨骼衰老表型的潜力。该研究为深入理解线粒体疾病相关的骨骼衰老机制提供了重要依据，为开发新的治疗策略奠定了基础，有望为线粒体疾病患者带来新的希望。