综述：可持续发展之路：有氧和无氧 C1 生物转化途径的定量比较

本文聚焦 C1 底物生物转化，通过计算不同途径和底物生产各类生物产品的理论最大产量，对比有氧和无氧 C1 同化途径，分析其优缺点，为生物制造选择合适路径提供依据，助力可持续生物经济发展。

引言

C1 底物，像 CO₂、一氧化碳、甲醇、甲酸和甲烷等，在未来可再生生物产品形成领域极具潜力。它们不与粮食生产竞争，常存在于废物流中，比传统原料（如葡萄糖）更经济环保。自然界中，有氧和无氧微生物都拥有多种利用 C1 底物的天然途径，近年来还开发出了合成途径。在设计新的 C1 生物工艺时，选择合适的生物和途径至关重要，而产品产量是关键考量因素。基于已知的途径化学计量和生物能学，可预测理论最大产量。本文计算了主要 C1 原料生产一系列产品的理论最大产量，同时回顾了主要 C1 途径及其工程化进展。

厌氧 C1 同化：Wood-Ljungdahl 途径

C1 同化分为厌氧和有氧途径。产乙酸菌和产甲烷菌利用还原型乙酰辅酶 A 途径（Wood-Ljungdahl 途径，WLP）在厌氧条件下代谢 C1 底物，WLP 是自然界中能量效率最高的 C1 固定途径。由于产甲烷菌专性产生甲烷，本研究未将其纳入分析。产乙酸菌因在非光合 CO₂固定方面具有高碳和能量效率，在 C1 生物制造领域备受关注。虽然目前商业化产品主要是乙醇，但合成生物学工具和系统水平表征的发展，为生产更多产品提供了可能。

天然有氧 C1 同化途径

与厌氧菌不同，有氧 C1 营养菌采用多种碳重排途径。Calvin-Benson-Bassham（CBB）循环是一种广泛分布的 CO₂固定途径，存在于许多光合和化能自养生物中。例如，模式菌 Cupriavidus necator 利用 CBB 途径同化 CO₂和甲酸，并且已被工程化用于异源产品形成和促进生长。CBB 途径还被引入大肠杆菌，使其能够自养生长。

核糖 - 5 - 磷酸途径（RuMP）是好氧甲基营养菌（如 Bacillus methanolicus 和 I 型甲烷氧化菌 Methylococcus capsulatus）同化甲醇的途径。丝氨酸循环是 II 型甲烷氧化菌和一些甲基营养菌（如 Methylorubrum extorquens）通过 CO₂和甲酸同化甲醇的替代途径。天然甲基营养菌已被广泛工程化用于甲醇生物转化生产异源产品，丝氨酸和 RuMP 途径也被引入模式异养宿主，使大肠杆菌能以与天然甲基营养菌相当的速率在甲醇上生长。此外，还有多种合成有氧 C1 途径，后续将进行讨论。

用线性代数形式快速计算理论产量

理论最大产品产量可根据连接底物和产品的生化反应的化学计量以及相关能量平衡进行代数计算。为了快速计算不同底物、同化途径和产品组合的产量，本文介绍了一种线性代数形式的计算方法。首先绘制从底物到产品的代谢途径，添加能量代谢相关的基本反应，得到一组化学计量平衡的方程。将这些方程转化为化学计量矩阵（S），通过向量乘法求解通量向量（x），进而计算产量。同时，还需计算每个反应的吉布斯自由能，确保产量在热力学上可行。通过两个例子展示了该工作流程，并揭示了有氧和产乙酸生物生产的一些生物学限制。

例 1：Acetobacterium woodii 从 CO₂/H₂厌氧生产 3 - 羟基丙酸

以 Acetobacterium woodii 通过 WLP 从 CO₂/H₂生产 3 - 羟基丙酸（3-HPA）为例，生产 1mol 3-HPA 需要 34mol H₂，H₂效率仅为 17.6%。分析通量向量发现，低 H₂效率是由于产生了 7mol 乙酸作为副产物。这凸显了产乙酸菌从 CO₂/H₂发酵生产产品的主要挑战：ATP 限制。此外，在厌氧环境中，产乙酸菌需要平衡分解代谢和生产途径中产生和消耗的辅酶，这些能量限制严重制约了产乙酸菌从 CO₂/H₂高产生产产品的种类。

例 2：Cupriavidus necator 从 CO₂/H₂有氧生产 3 - 羟基丙酸

Cupriavidus necator 利用 CBB 循环同化 CO₂，并通过有氧电子传递链从 H₂产生 ATP 来生产 3-HPA。该过程的 H₂效率（52%）远高于 Acetobacterium woodii，且没有碳副产物。然而，CBB 循环固定 CO₂的 ATP 成本较高（每固定 1 个 CO₂需要 2 个 ATP），这限制了 H₂的利用效率。

途径、底物和产品的全面比较

有氧和厌氧天然途径都存在局限性，为此人们开发了多种代谢工程和过程工程方法来提高产量。例如，设计更高效的合成有氧 C1 同化途径，以及采用两阶段系统（顺序培养），即由产乙酸菌在厌氧条件下将 C1 原料转化为乙酸，再由好氧微生物在第二个反应器中将乙酸转化为所需产品。顺序培养法可将能量限制转化为优势，提高碳产量。本文对多种途径、底物和产品的理论最大产量进行了全面分析，结果表明，根据产品和底物的不同，最大产量的途径也不同，凸显了选择合适生物和途径的重要性。

厌氧 C1 固定与有氧产品形成相结合可实现超高产量

顺序培养法利用了厌氧 C1 固定的高效率和好氧代谢产生 ATP 的高能力，协同提高了产量。该方法在几乎所有底物和产品配对中都优于其他方法，尤其是当乙酸作为目标产品时，产乙酸菌的产量接近 100%。同时，好氧微生物避免了高 ATP 成本的 CO₂固定，将更多底物用于生产目标产品。不过，传统的顺序培养需要两个反应器，增加了技术复杂性和资本成本，还存在 pH 控制困难和中间底物浓度难以积累等问题。近年来，有研究在单个反应器中实现了顺序培养概念，通过时间上而非空间上分离两种代谢模式，且实验表明微生物在有氧和无氧条件转换下仍能保持活性，为单反应器顺序培养提供了可能。

合成 C1 利用途径提高产量

近年来出现了多种合成 C1 利用途径，旨在实现更高效的 C1 生物转化。其中，还原甘氨酸途径（rGlyP）表现突出，与天然途径相比，它提高了从甲酸和甲醇生产几乎所有产品的产量。rGlyP 已在多种工业宿主中用于支持生长和产品形成，并且通过理性工程和适应性实验室进化，在 Cupriavidus necator 中实现了比天然 CBB 途径更高的生物质产量，在产乙酸菌 Butyribacterium methylotrophicum 中增强了对甲醇和 CO₂的共利用能力。此外，rGlyP 还在大肠杆菌等异源宿主中成功实现，使其能以甲酸或甲醇为唯一碳源生长。不过，目前利用这些工程生物生产增值化合物的产量仍有待提高，其他合成途径如 CETCH 循环、FORCE 途径和 SACA 途径虽有潜力，但因尚未报道能支持细胞仅以 C1 底物生长，未纳入本研究分析。

甲醇是有氧和厌氧转化的有吸引力的原料

甲醇在 C1 底物中产量最高，这主要得益于其较高的还原度，在某些情况下可支持同时固定 CO₂，使产量超过 100%，尤其有利于那些生物合成需要额外 CO₂的产品。好氧甲基营养菌在工业应用中存在诸多挑战，如甲醇代谢产生有毒中间产物甲醛，需要精心设计进料系统，且代谢产热多，增加冷却成本。此外，中温菌中 NAD 依赖的甲醇氧化在热力学上具有挑战性。甲基营养酵母通过特定方式克服了部分问题，但能量效率较低，产量低于甲基营养细菌。革兰氏阴性甲基营养菌的甲醇脱氢酶与电子传递链相连，无法为产品生物合成提供还原当量。相比之下，甲基营养产乙酸菌克服了毒性和热力学问题，且不降低产量，它们利用四氢叶酸（THF）作为甲基载体避免甲醛，部分菌还通过特殊酶使 NAD 依赖的氧化在热力学上更有利。从生物加工角度看，厌氧甲醇氧化产热少，无需曝气，降低了反应器成本，且与好氧甲基营养菌的甲醇摄取速率相似。不过，产乙酸菌甲醇转化存在生长速率低和合成生物学工具理解有限的问题，但近期在 Eubacterium limosum 研究上取得的进展为改善厌氧甲醇利用和产品形成带来了希望。

Wood-Ljungdahl 途径中的辅酶变化显著影响产品产量

不同产乙酸菌在 WLP 关键酶使用的辅酶和能量守恒机制上存在显著差异。以 A. woodii、C. ljungdahlii、E. limosum 和 M. thermoacetica 为例，它们在亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、甲酸脱氢酶（FDH）/ 氢依赖的 CO₂还原酶（HDCR）以及能量守恒使用的 Ech 和 Rnf 复合物方面存在不同。这些辅酶差异导致不同产乙酸菌在不同底物上生产不同产品的理论最大产量有很大差异。例如，M. thermoacetica 在 CO₂/H₂上的表现通常优于 A. woodii，但在甲醇上产量较低。这一分析为未来产乙酸菌研究指明了两个重要方向：一是确定 C. ljungdahlii 和 E. limosum 中神秘的 MTHFR 的氧化还原伙伴，二是利用产乙酸菌基因组工程工具的进展，探索替换具有不同辅酶特异性的天然 WLP 酶对产品形成的影响，有望提高产品产量。

局限性和改进机会

本文的建模方法采用了最新的生化模型，但存在一些近似和简化。最重要的是忽略了维持能量，且假设生物质生成可忽略不计。对于有实验测定维持需求的生物，可通过在 b 向量中为 ATP 添加非零积累项来考虑维持能量；考虑生物质形成时，可在 S 矩阵中添加生物质生成反应列和生物质物种行，并在 b 向量中添加积累项。不过，由于许多微生物的维持系数实验值不可用，且假设生长和生产阶段经典解耦，本研究未考虑这些因素。此外，本文模型比常用于产量分析的基因组规模模型（GSMs）简单，其优势在于无需假设目标函数，分析基于核心代谢中生化特征最明确且对最大产量影响最大的部分，可在不开发和验证复杂 GSMs 的情况下，对不同途径的相对优点得出重要结论。

结论和未来研究方向

通过本文的产量分析工作流程，可对不同产品、同化途径和底物的理论最大产量进行广泛比较。将该框架应用于 C1 同化途径，揭示了未来提高 C1 原料生物生产的研究机会。厌氧 C1 固定与有氧产品形成相结合前景广阔，特别是单反应器实现的可能性；高效 ATP 的合成途径（如 rGlyP）有望使有氧 C1 利用在产量上与 WLP 相媲美；从产量角度看，甲醇是极具吸引力的底物，产乙酸菌甲醇转化克服了好氧转化的主要生物加工挑战，仍能高产生产多种高价值产品；WLP 中辅酶使用差异对产量的显著影响，凸显了解决产乙酸生化问题和通过辅酶工程提高产量的重要性，随着遗传工具的不断发展，这一领域具有很大潜力。