在昆虫的生命历程中，表皮作为其身体的重要屏障，对于维持昆虫的正常生理功能至关重要。表皮的主要成分包括几丁质、蛋白质和脂质等，这些成分通过复杂的交联作用形成坚韧且具有弹性的结构。而 3,4 - 二羟基苯乙醛合酶（DHPAAS）作为一种关键酶，被认为与昆虫表皮的交联剂前体 3,4 - 二羟基苯乙醛（DHPAA）的生成密切相关。然而，DHPAAS 如何催化这一过程，其在表皮形成中的具体作用机制，以及该酶的结构特征如何影响其功能等问题，一直尚未完全明确。此外，虽然已有研究表明 DHPAAS 与昆虫的生长发育和生存有关，但对于其在分子层面上如何调控表皮成分的合成和组装，仍存在诸多未知。因此，深入研究 DHPAAS 的功能和作用机制，对于揭示昆虫表皮形成的奥秘具有重要意义。
为了回答这些问题，海南大学、东京农工大学等机构的研究人员开展了相关研究。研究人员以埃及伊蚊为研究对象，通过一系列实验，解析了昆虫 DHPAAS 的晶体结构，揭示了其催化机制，并明确了该酶在埃及伊蚊表皮形成中的关键作用。相关研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是 RNA 干扰（RNAi）技术，用于敲低埃及伊蚊中 DHPAAS 的表达，以观察其对昆虫生长发育和表皮结构的影响；二是固态 13C 核磁共振（NMR）分析，用于测定埃及伊蚊表皮的分子结构，检测其中是否存在源自 DHPAA 的邻苯二酚结构；三是晶体学技术，通过解析果蝇 DHPAAS（DmDHPAAS）与 PLP 复合物的晶体结构，从分子层面揭示 DHPAAS 的结构特征；四是分子动力学模拟，用于分析 DHPAAS 的动态构象变化及其与底物的相互作用。
结果
1. 腹部完整性因成年雌雄蚊子而异
在选择成年蚊子进行 AeDHPAAS 敲低实验之前，首先比较了雄性和雌性成年蚊子处理腹部注射的能力。注射林格氏液前，雄性和雌性成年蚊子的腹部均呈扁平状。注射后，雌雄成虫腹部均肿胀。但雌性成虫注射 3-5μL 溶液后可存活，而雄性成虫最多注射 0.3-0.4μL 溶液后才能存活。基于腹部注射结果，后续 RNAi 实验选择雌性成年蚊子。
2. DHPAAS 敲低增加死亡率并减少血餐摄入量
实时荧光定量 PCR（qPCR）显示，RNAi 组中 AeDHPAAS 的相对表达量比对照组显著降低 75%。同时，对照组中很少有雌性成虫在注射 4μL 林格氏液后死亡，而 AeDHPAAS 敲低的成虫中约 50% 未能存活。测量血餐前后成年蚊子的体重，对照组和实验组之间无显著差异。但 AeDHPAAS 敲低的成虫血餐重量仅约 2mg，显著低于对照组的 3.7-4mg。
3. DHPAAS 敲低破坏腹部表皮
AeDHPAAS RNAi 敲低后，在产卵后 3 天内，40±3.3% 的成年雌性蚊子死亡，而对照组仅有 5% 死亡。此外，存活的 AeDHPAAS 敲低蚊子中，25±5% 对腹部注射林格氏液的耐受性降低，腹部破裂频率较高。
4. DHPAAS 敲低降低卵孵化率
AeDHPAAS 敲低对蚊子产卵数量无显著影响，每只蚊子产卵约 100±20 枚。但卵孵化率显著受抑，对照组卵孵化率为 90±5%，而 AeDHPAAS-dsRNA 处理组为 53±28%。处理组约 60% 未孵化卵内无幼虫，且在湿度降低后迅速脱水，对照组卵则不会。剩余约 40% 未孵化卵内有成型幼虫但无法孵化。
5. DHPAAS 敲低改变表皮结构
透射电子显微镜（TEM）观察显示，对照组中内表皮比外表皮厚，而 AeDHPAAS RNAi 组的内表皮层相对外表皮更薄。
6. 蚊子表皮中观察到含邻苯二酚环的化合物
固态 13C NMR 分析显示，埃及伊蚊表皮样品的 13C 交叉极化 / 魔角旋转（CP/MAS）NMR 谱中可观察到 115-145ppm 的化学位移，对应邻苯二酚环碳。145ppm 处的宽峰可归因于邻苯二酚环 3 和 4 位的碳核，支持 DHPAA 的邻苯二酚环存在于蚊子表皮的假设。
7. DHPAAS 敲低改变基因表达
RNA-seq 分析显示，AeDHPAAS 敲低后，59 个与发育相关的基因差异表达，其中仅 5 个基因上调，其余下调。与对照组相比，117 个表皮蛋白相关基因、106 个几丁质代谢相关基因和 109 个脂质代谢相关基因差异表达，多数呈上调趋势。此外，固醇载体蛋白 2（SCP-2）和脂 ophorin 受体（LpR）基因表达也有有趣变化。
8. 昆虫 DHPAAS 的晶体结构揭示不同特征
解析的 DmDHPAAS 晶体结构为二聚体，其活性位点位于同源二聚体的单体 - 单体界面。与同源酶 DmDDC 相比，DmDHPAAS 的 320-350 区域更有序，Phe103 和 Leu353 含有的环分别远离和靠近催化 Asn192 残基，形成特定疏水隧道，可能有助于向 PLP 输送氧气。
9. AeDHPAAS 和 DmDHPAAS 显示相似的分子动力学
以 DmDHPAAS 晶体结构为模板构建 AeDHPAAS 同源模型，分子对接和动力学模拟显示，AeDHPAAS 和 DmDHPAAS 在模拟过程中活性位点特征相似，Phe103 和对应 Phe106 远离 LLP，而 DmDDC 的 Phe103 靠近 LLP。
结论与讨论
本研究从生理水平到分子水平全面表征了 DHPAAS，为其在表皮形成中的作用提供了更完整的见解。生理结果表明，AeDHPAAS 敲低导致腹部表皮缺陷，影响血餐摄入、生存和卵孵化。固态 NMR 证据支持蚊子表皮中存在可能源自 DHPAA 的含邻苯二酚化合物。DHPAAS 的晶体结构揭示了其独特的疏水隧道结构，为 PLP 依赖的氧化机制提供了结构基础，解释了其催化生成 DHPAA 的过程。这些发现不仅深化了对昆虫表皮组装分子机制的理解，也为开发针对蚊媒疾病的新型防治策略提供了潜在靶点，例如通过干扰 DHPAAS 的功能来破坏蚊子表皮形成，从而抑制其生长发育和传播疾病的能力。此外，研究还为 PLP 依赖酶的催化机制和生物相关性提供了新的认识，具有重要的科学意义和应用前景。
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