在生命科学领域，辅助生殖技术（ART）的成功与否与卵母细胞质量密切相关。母源 RNA 代谢在卵母细胞成熟及早期胚胎发育中起着关键作用，其代谢过程受到 RNA 修饰和 poly (A) 结构等调控。然而，现有的 RNA 测序方法难以在单细胞水平同时捕获 RNA 的完整结构信息，如 5′端的 m⁷G 帽、3′端的 poly (A) 尾，以及 m⁶A、m⁶Aₘ等修饰，这极大限制了对母源 RNA 代谢机制的深入理解。此外，m⁶Aₘ修饰由于需要大量 RNA 样本且现有方法无法与 m⁶A 区分，在卵母细胞和早期胚胎中的研究几乎空白。因此，开发一种能够全面分析 RNA 分子完整结构和修饰的技术，对于揭示卵母细胞成熟机制、优化 ART 中的卵母细胞选择具有重要意义。
为解决这些问题，郑州大学第一附属医院联合香港中文大学等机构的研究人员开展了相关研究。他们开发了一种名为 Cap to Tail 测序应用（C2T-APP）的新技术，并利用该技术对人和小鼠卵母细胞成熟过程中的 RNA 多组学特征进行了深入分析。研究成果发表在《BMC Biology》上，为卵母细胞成熟机制的研究和辅助生殖技术的发展提供了新的视角和工具。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先是 C2T-APP 技术的开发，该技术基于单细胞 m⁶A 测序（scm⁶A-seq），通过优化实验流程，能够同时捕获 RNA 的 m⁷G 帽、poly (A) 尾结构及基因表达水平。研究使用的样本包括人未成熟卵母细胞（GV 期、MII 期及退化卵母细胞）和小鼠胚胎干细胞（mESC）。通过 RNA 测序和生物信息学分析，系统解析了 RNA 的 5′和 3′末端结构、修饰及转录组特征。
研究结果
1. C2T-seq 的开发与 m⁷G 帽的鉴定
研究人员通过改进传统 RNA 测序流程，开发了 C2T-seq 技术。该技术利用模板转换反应和 poly (A) 选择步骤，能够保留 RNA 的完整结构信息。通过分析 cDNA 末端的非模板 G 碱基分布，成功鉴定出 m⁷G 帽结构。与 CAGE-seq 数据对比显示，C2T-APP 鉴定的 m⁷G 位点具有较高的准确性和重复性，证明了该技术在 m⁷G 帽检测中的有效性。
2. C2T-APP 实现 RNA 分子从帽到尾的全面分析
建立的 C2T-APP 分析流程可从单细胞 RNA-seq 数据中提取帽读段、尾读段和基因体读段，实现对基因表达的多维度定量。应用于 mESC 转录组分析，发现该技术能准确检测非 poly (A) 转录本和无 m⁷G 帽基因，如组蛋白基因，揭示了传统方法未能覆盖的转录组特征。
3. 替代多聚腺苷酸化（APA）位点及 poly (A) 尾分析
利用 C2T-seq 数据进行 APA 位点分析，鉴定出 4621 个高置信度 APA 位点，包括许多新位点和编码序列（CDS）内的位点。poly (A) 长度分析显示，mESC 转录组的平均 poly (A) 长度为 55-75 bp，与先前报道一致。此外，发现 U 尾修饰的转录本 poly (A) 尾显著更短，表明 C2T-APP 能精确分析 poly (A) 结构特征。
4. 从 scm⁶A-seq 数据中识别 m⁶Aₘ修饰
结合 m⁷G 帽识别，C2T-APP 从 scm⁶A-seq 数据中成功区分 m⁶Aₘ和 m⁶A 修饰。在小鼠卵母细胞中鉴定出 587 个 m⁶Aₘ基因，GO 分析显示其富集于应激反应功能。进一步研究发现，m⁷G 帽水平与翻译效率呈正相关（r=0.26），且 m⁶Aₘ修饰的转录本与翻译效率的相关性更高，表明 m⁷G 和 m⁶Aₘ共同促进母源 RNA 的翻译。
5. 母源 RNA 清除与翻译的依赖关系
通过翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理实验，发现母源 RNA 的去腺苷酸化（poly (A) 尾去除）依赖于翻译，而 m⁷G 帽结构相对不受影响。蛋白质组分析显示，poly (A) 尾调控因子在 MII 期卵母细胞中通过翻译积累，而 m⁷G 帽调控因子大多保持稳定，揭示了母源 RNA 代谢中翻译依赖的调控机制。
6. poly (A) 尾结构对翻译效率的调控
结合 GV 和 MII 期样本的多组学数据，将母源 RNA 分为四类，发现无 poly (A) 尾的转录本翻译效率显著降低。GO 分析显示，poly (A) 调控的翻译动态基因富集于细胞分裂、染色质重塑等功能，表明 poly (A) 尾结构通过影响翻译效率重塑母源 RNA 代谢，调控卵母细胞成熟进程。
7. 人类卵母细胞的多组学特征分析
对不同质量的人卵母细胞进行 scm⁶A-seq 和 C2T-APP 分析，发现优质卵母细胞与退化或停滞卵母细胞在 m⁷G、m⁶A、m⁶Aₘ和 poly (A) 结构等表观转录组特征上存在显著差异。PCA 分析显示，多组学特征能有效区分不同形态的卵母细胞，揭示了卵母细胞成熟过程中 RNA 代谢的高度异质性。
研究结论与讨论
本研究开发的 C2T-APP 技术为 RNA 组学研究提供了一种全面、高效的工具，首次实现了单细胞水平上对 RNA 的 m⁷G 帽、m⁶Aₘ、m⁶A、poly (A) 尾结构及基因表达的多维度分析。研究揭示了人及小鼠卵母细胞成熟过程中母源 RNA 代谢的动态机制，包括 m⁷G 和 m⁶Aₘ对翻译效率的促进作用、poly (A) 尾依赖的翻译调控以及母源 RNA 清除的分步机制。此外，发现低质量人卵母细胞存在表观转录组特征缺陷，为 ART 中卵母细胞质量评估和优化提供了新的生物标志物。
尽管研究取得了重要进展，但仍存在一定局限性，如人卵母细胞样本量有限、部分机制研究仍需深入。未来需结合更大样本量和多组学技术，进一步阐明 RNA 修饰和结构调控卵母细胞成熟的分子机制，为改善辅助生殖技术临床结局提供更坚实的理论基础。总之，该研究不仅填补了 RNA 多组学在卵母细胞研究中的技术空白，还为生殖医学领域的基础研究和临床应用开辟了新的方向。
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