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本综述系统探讨了肾癌周脂肪组织（hRAT）通过上调缺氧诱导因子（HIF1α/HIF2α）及血管内皮生长因子（VEGF）表达，显著促进内皮细胞迁移（wound healing/transwell assay）和管状结构形成（tubulogenesis）的分子机制。研究揭示了脂肪微环境通过分泌促血管生成因子（如VEGF）驱动肿瘤血管化的新途径，为肾细胞癌（ccRCC）靶向治疗提供了潜在新策略。
肾细胞癌（RCC）是最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一，其中透明细胞肾细胞癌（ccRCC）占肾脏肿瘤的80%–90%，具有高度化疗耐药性和易转移特性。约30%的ccRCC患者在诊断时已处于晚期或转移阶段，另有20%–30%会在疾病进程中发生转移。血管生成（angiogenesis）作为新生血管形成的关键过程，对肿瘤的生长和转移至关重要。在"无血管"阶段，肿瘤通过邻近血管获取营养和氧气，而激活血管生成过程对于确保肿瘤活跃增殖和无营养限制的生长是必需的。
肿瘤微环境由血管、淋巴管、成纤维细胞、干细胞和脂肪细胞等组成。脂肪组织（AT）不仅具有能量储存和释放功能，还被认为是一个具有内分泌和免疫调节功能的器官。近年研究表明，脂肪组织分泌的生长因子和细胞因子显著影响多种疾病（包括癌症）的进展。肿瘤周脂肪组织通过旁分泌作用与肿瘤细胞相互作用，同时肿瘤细胞也会改变周脂肪组织的结构和功能。这种相互作用导致成熟脂肪细胞和脂肪干细胞发生变化，肿瘤细胞刺激脂肪细胞去分化，使其重新排列细胞骨架并形成成纤维细胞样表型。与正常脂肪细胞相比，肿瘤周脂肪细胞表现出改变的表型，被称为癌症相关脂肪细胞（CAA）。
缺氧是血管生成的主要触发因素之一，调节缺氧诱导转录因子（HIFs）的激活。HIFs在缺氧肿瘤细胞中起关键作用，驱动炎症和血管生成。这些蛋白质由三个α亚基（HIF1α、HIF2α和HIF3α）和一个β亚基（HIF1β）组成。在常氧条件下，Von Hippel Lindau（VHL）基因产物pVHL形成E3泛素连接酶分子复合物，靶向HIFs进行蛋白酶体降解。在VHL缺失的情况下，缺氧反应基因因HIFs而上调。HIF1α和HIF2α在不同组织中表达，调节参与血管生成（如VEGF）、细胞增殖和炎症、上皮-间质转化、凋亡、转移和肿瘤侵袭的靶基因，它们的表达与不同的疾病状态相关。
在转移性ccRCC患者中，肾周脂肪组织表现出M2巨噬细胞的增加，这些巨噬细胞分泌血管生成因子和细胞因子，从而促进血管生成和癌症进展。然而，肾周脂肪组织是否通过向肿瘤微环境释放因子直接调节局部血管生成仍不清楚。
研究纳入了疑似肾癌患者或健康肾脏捐赠者。在签署知情同意书后，使用标准问卷收集社会人口统计学、医学和生活方式因素信息。从接受部分或全肾切除术且未接受过化疗或放疗治疗的患者中获取癌肾人类肾脂肪组织外植体（hRAT）。从活体肾脏捐赠者中获取正常肾脏的人类脂肪组织外植体（hRAN）。肾周脂肪组织活检取样方式如下：对于活体肾脏捐赠者，脂肪组织片段取自肾脏中部区域（中极）1厘米处；对于肾癌患者，脂肪组织片段也取自肾脏1厘米处，同时考虑肿瘤位置，尽可能接近中部区域。所有情况下，活检均远离肾上腺（去甲肾上腺素来源）。
患者体重指数（BMI）中位数为：肾肿瘤患者（hRAT）26.8 kg/m2，活体肾脏捐赠者（hRAN）24.9 kg/m2。活体肾脏捐赠者中57%为女性，43%为男性，平均年龄44岁（±7）。ccRCC患者中27%为女性，73%为男性，平均年龄56岁（±14）。所有患者均来自阿根廷门多萨省人口。
样本在PBS中运输并立即处理，每个样本的一部分存储在-80°C，另一部分在无菌层流罩下处理。该项目获得医学院伦理委员会批准（阿根廷国立库约大学，EXP-CUY: 11722–2016），符合赫尔辛基人体实验宣言。所有患者均签署知情同意书。
使用Trizol试剂从100 mg组织（hRAN n=8；hRAT n=8）中提取总RNA，并通过260/280 nm吸光度定量。使用随机六聚体引物和Moloney鼠白血病病毒逆转录酶在37°C下将2 μg总RNA逆转录为20 μL反应混合物。RNA首先在70°C下与2.5 μg随机六聚体引物变性5分钟。随后加入RT缓冲液[50 mM Tris–HCl (pH8.4), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2]、0.5 mM dNTPs、5 mM DTT、200单位M-MLV逆转录酶，在37°C孵育50分钟，然后在70°C加热15分钟灭活反应。cDNA存储在-20°C。
使用表1中描述的特定引物通过RT实时PCR估计每个基因的mRNA含量。PCR反应使用Corbett Rotor Gene 6000实时热循环仪和HOT FIREPol® DNA聚合酶进行。PCR反应在95°C孵育15分钟开始，随后进行40个循环：95°C 30秒，表1所示的退火温度30秒，72°C 30秒。使用熔解曲线分析检查是否生成单一特异性扩增产物。实时定量通过测量每个扩增周期结束时荧光增加来监测。使用校准样品（对照样品）的标准化样本的比较定量方法确定相对表达。每个PCR运行包括无模板对照和无逆转录酶的样品。所有测量在两次独立实验中每个样品重复进行。反应条件和加入的cDNA量经过校准，确保对每对引物的输入cDNA量呈线性响应。mRNA相对水平通过GAPDH参考基因标准化。
脂肪组织用冷PBS 1×洗涤并称重。将hRAN或hRAT铺在培养瓶中，加入M199培养基（1 g组织/10 mL M199），在37°C、5% CO2下孵育1小时。之后移除培养基，更换新鲜培养基，组织孵育24小时。收集上清液，用无菌0.22 μm膜过滤，然后分装成1 mL等分试样，立即存储在-80°C。对照条件培养基通过将无血清M199培养基在37°C、5% CO2下孵育24小时后收集获得。
使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定hRAN-（n=10）或hRAT-CMs（n=19）中的VEGF水平。简要流程：用捕获抗体（2 μg/mL纯化兔抗VEGF多克隆IgG）在0.1 M碳酸钠（pH 9.5）中包被高结合96孔微孔板，在4°C孵育18小时。用洗涤缓冲液（PBS中0.05% Tween-20）冲洗孔三次，用封闭溶液[2%牛血清 albumin (BSA) in PBS]在室温孵育1小时。样品和标准品（100 μL）在1% BSA–Tween-20中稀释，在4°C孵育18小时。洗板后与100 ng/mL生物素化检测抗体（纯化兔抗VEGF多克隆IgG）孵育1小时。冲洗三次后加入0.33 μg/mL HRP标记的链霉亲和素（Sigma-Aldrich）孵育30分钟。洗涤后加入100 μL TMB溶液（0.1 mg/mL四甲基联苯胺和0.06% H2O2 in citrate–phosphate buffer, pH 5.0）。通过加入2 N H2SO4停止反应。在Multiskan MS微孔板读数仪中测定450 nm光密度。并行运行从2.5到160 ng/mL VEGF的标准曲线。
从脐带中分离HUVECs，基本按照Bannoud等人描述的方法进行，获得医学院伦理委员会批准（阿根廷国立库约大学，ref. EXP-CUY: 4693–2018并在2019年更新）和门多萨中心医院研究伦理委员会批准（批准记录：10/2022）。
96孔板用Geltrex®包被，在37°C保持30分钟。之后回收多余明胶，接种细胞（每孔2.5×104个细胞）。HUVEC细胞在含15% FBS和10 ng/mL VEGF的完全培养基中生长。汇合细胞单层用移液器吸头划痕，用PBS洗涤两次，并用hRAN-CM（n=6）、hRAT-CM（n=6）或M199生长培养基（阴性对照）处理，所有条件均用RPMI 2% FBS稀释，阳性对照为含20 ng/mL VEGF的RPMI 15% BFS。捕获0小时图像记录初始伤口宽度。在6和12小时后评估由于细胞向裸露区域迁移导致的伤口单层恢复情况。使用倒置相差显微镜（Olympus CKX-41）和4×物镜获取图像。使用ImageJ分析软件通过多边形选择模式进行量化，确定6或12小时伤口面积相对于对照（0小时）的百分比。
将HUVEC细胞（3×104个细胞/0.2 mL）放入具有8 μm孔膜的顶部transwell（COSTAR® cat. #03123015）。然后用hRAN-CM（n=6）、hRAT-CM（n=6）、阴性对照（M199生长培养基，n=6）（所有用RPMI 2% FBS稀释）和阳性对照（含20 ng/mL VEGF的RPMI 15% FBS，n=3）孵育，允许细胞穿过多孔膜迁移18小时。实验结束后，取出插入物，用0.1%结晶紫在20%甲醇（Sintorgan®）溶液中染色10分钟。用蒸馏水洗涤插入物，用棉签去除上膜表面的细胞。空气干燥的膜在20×放大倍数下观察，每个膜随机选择五个视野计数迁移细胞。
在Geltrex包被的板上评估毛细血管样管状结构的形成。简要流程：将HUVECs（1.5×104个细胞）与不同条件培养基混合，然后铺在Geltrex包被的96孔板上，在37°C孵育12小时，或 alternatively铺在Geltrex包被的μ-slide angiogenesis（Ibidi®）上孵育6–8小时。通过相差显微镜可视化毛细血管样管状结构，并通过计数每孔管状结构（封闭区域）数量进行记录。
使用GraphPad Prism version 8进行统计分析。对于两个数据集之间的比较，根据情况使用Mann–Whitney或Welch校正的t检验。对于多重比较，使用单因素ANOVA followed by Tukey's或Dunnett's事后检验（参数分析）或Kruskal–Wallis检验 followed by Dunn's事后检验（非参数分析）。p值小于0.05被认为显著。
研究人员评估了不同脂肪组织片段中血管生成调节因子的基因表达谱。通过测量正常和肿瘤肾脏样本脂肪组织中HIF-1α、HIF-2α和VEGF的mRNA水平，发现hRAT外植体中HIF1α和HIF2α的基因表达高于hRAN外植体。两组间VEGF mRNA表达未发现统计学显著差异。
为了评估hRAN-和hRAT-CMs中VEGF蛋白的分泌情况，研究人员进行了ELISA实验。观察到hRAT-CMs中VEGF分泌较hRAN-CMs有接近显著性的升高趋势（p=0.052）。
为了确定HUVEC细胞在不同条件培养基孵育后的迁移能力，研究人员进行了伤口愈合实验。HUVEC细胞生长、划痕后，用hRAN-、hRAT-、VEGF对照（阳性对照）和M199对照（阴性对照）条件培养基处理。孵育6和12小时后，hRAT-CMs显著增强HUVEC迁移，与hRAN-CMs和M199对照-CMs相比。然而，阳性对照仅在12小时后增强HUVEC迁移，与hRAN-CMs和M199对照CMs相比。
为了评估HUVEC细胞由于脂肪组织分泌的化学吸引因子而导致的跨迁移能力，研究人员进行了Transwell实验。HUVEC细胞在完全生长培养基中生长，并用hRAN-、hRAT-、VEGF-（阳性对照）和M199-（阴性对照）条件培养基处理。孵育18小时后，hRAT-CMs显著增强HUVEC通过插入物的跨迁移，与hRAN-和M199-CMs相比。
为了评估hRAT-和hRAN-CMs的血管生成活性，研究人员进行了管状形成实验以模拟三维血管的形成。为了评估HUVEC细胞是否确实能够形成新管状结构，设置了VEGF-CM组作为实验的阳性对照。该组显示与hRAN-CM相比管状形成非常显著增加。此外，观察到hRAT-CMs显著增加ECs管状网络的形成，与hRAN-CMs相比。
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾细胞癌最常见的形式，也是最致命的泌尿系统恶性肿瘤之一。事实上，远处转移是ccRCC相关死亡的主要原因。ccRCC转移涉及的分子机制尚未完全阐明。大多数ccRCC中最早期的致癌事件是肿瘤抑制基因VHL的功能丧失。这种失活导致HIF-1α和HIF-2α的组成型稳定化，促进 several oxygen-independent hypoxic transcriptional programs的激活，从而诱导血管生成、上皮-间质转化、侵袭和转移扩散。VEGF是内皮细胞增殖和血管生成的有效刺激因子，由脂肪细胞和脂肪干细胞（ASCs）表达。HIF1α和HIF2α在不同组织中表达，调节参与血管生成、细胞增殖和炎症的靶基因，它们的表达与不同的疾病阶段相关。HIFs在癌症中的参与已得到广泛研究，HIF2α特异性抑制剂正在临床试验中研究用于治疗肾癌等癌症类型。
最近，研究小组证明，来自肾肿瘤患者肾脂肪组织（hRAT）的条件培养基（CM）与正常脂肪组织（hRAN）的CM相比，增加了肿瘤和非肿瘤肾上皮细胞的迁移。接下来，研究人员表明hRAT-CMs在肿瘤和非肿瘤肾上皮细胞中增加间质标志物（如desmin、N-cadherin和vimentin）的表达，并且脂肪组织可以刺激上皮-间质转化（EMT），从而刺激细胞的转移能力。因此，在这项工作中，研究人员评估了人类肾周脂肪组织是否能够刺激肿瘤微环境中的血管生成和迁移，从而促进肾肿瘤细胞的生长和转移能力。
脂肪组织血管丰富，除了脂肪细胞因子如leptin外，还分泌白细胞介素、生长因子如成纤维细胞生长因子（FGF）和血管生成因子如血管生成素2和VEGF。研究表明，与hRAN相比，hRAT表达更高量的HIF-1α和HIF-2α mRNA。HIF-1α可以诱导VEGF过表达并促进癌症进展。尽管未发现hRAT和hRAN之间VEGF mRNA基因表达存在显著差异，但通过ELISA证明hRAT比hRAN分泌更大量的VEGF蛋白，Sarkanen等人在脂肪组织提取物中也发现了类似结果。
研究人员随后评估了不同类型脂肪组织血管生成因子的这种差异表达是否与内皮细胞的不同反应及其形成新血管的能力相关。观察到hRAT-CMs通过伤口愈合和transwell实验增加了HUVECs的迁移。令人惊讶的是，观察到HUVECs在与hRAT-CMs孵育6小时后显示出显著迁移， measured as a smaller wound area；而与VEGF-CMs对照（阳性对照）孵育12小时后才出现显著闭合。这可能是因为hRAT-CMs不仅含有更高水平的VEGF，还可能含有其他尚未鉴定的可溶性因子，这些因子有助于内皮细胞迁移。先前研究表明，肿瘤周脂肪组织比非肿瘤性肾周脂肪组织表达和分泌更大量的leptin。Leptin通过刺激血管内皮细胞中的JAK/STAT3 pathway和刺激VEGF production发挥促血管生成作用。除了VEGF，hRAT-CMs中存在的其他因子可能是观察到的促血管生成效应的原因。例如，Wagner等人证明了肿瘤周脂肪组织中巨噬细胞的重要性及其在IL-6分泌中的关键作用，假设这种白细胞介素作为一种可能的血管生成因子和内皮细胞增殖诱导剂。评估健康患者和肾癌患者肾周脂肪组织片段中巨噬细胞的存在以及CMs中IL-6的表达将是有趣的。
关于CMs的管状形成能力，研究发现hRAT-CMs与hRAN-CMs相比显著增加了HUVEC细胞的管状形成。结果与Saiki等人、Rubina等人和Verseijden等人相关，他们报道脂肪干细胞（ASCs）和3T3-L1细胞系（所有脂肪细胞谱系）促进HUVEC细胞的管状形成。上述作者展示了脂肪细胞培养物的促血管生成效应，但缺乏关于癌症背景下成熟脂肪组织促血管生成能力的信息。这是首批证明肾周脂肪组织条件培养基可以刺激内皮细胞迁移和体外管状形成的研究之一，表明可溶性因子（如VEGF）的存在可能有助于血管生成和潜在的肿瘤进展。研究表明淋巴管生成可能通过作为转移扩散的途径促进肿瘤进展，因此认为有必要在这方面进行进一步研究。
研究表明，来自肾周脂肪组织的条件培养基含有更高水平的VEGF，并促进HUVEC细胞系的血管生成反应。这些发现表明，周脂肪组织分泌的可溶性因子可能有助于肿瘤微环境内的血管生成，并可能影响肾肿瘤的进展。
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