温度与共溶质协同调控牛血清白蛋白(BSA)液-液相分离(LLPS)的机制与表征研究

本研究针对生物分子液-液相分离（LLPS）的调控机制问题，通过温度依赖浊度、光学显微镜和ATR-FTIR光谱技术，揭示了PEG-5000浓度和温度对牛血清白蛋白（BSA）LLPS的协同调节作用。发现液滴尺寸随温度升高而减小（10°C时约9μm，20°C时约3μm），并通过红外光谱首次无标记估测液滴内蛋白浓度达初始溶液50倍（5mM），且二级结构未发生改变。该研究为LLPS定量分析和病理机制探究提供了新方法。

在拥挤的细胞内环境中，生物分子通过液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）形成无膜细胞器，这一过程在信号转导、转录调控等生理过程中起关键作用。然而，异常LLPS可能导致神经退行性疾病和癌症等病理状态。尽管LLPS现象在多种蛋白质中被报道，但其形成条件、液滴内蛋白浓度及结构变化仍缺乏精准的定量表征手段。牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）作为一种模型蛋白，在特定条件下可发生LLPS，但温度与共溶质（如聚乙二醇PEG）的协同调控机制尚不明确。

为探究这一问题，来自意大利卡拉布里亚大学的研究团队在《Archives of Biochemistry and Biophysics》发表了题为"Temperature and cosolute regulate the liquid-liquid phase separation in BSA solutions"的研究论文。该工作通过多技术联用揭示了PEG浓度和温度对BSA的LLPS行为的精细调控，并首次利用ATR-FTIR光谱实现了液滴内蛋白浓度的无标记定量评估。

研究主要采用以下技术方法：1）温度依赖浊度实验（UV-Vis spectrophotometry）监测LLPS相变温度；2）光学显微镜（Optical microscopy）观察液滴形态与尺寸分布；3）衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR spectroscopy）进行时间与温度依赖的蛋白沉积动力学和二级结构分析。所有实验均在pH 4.6的乙酸钠缓冲体系中进行，BSA浓度固定为100μM，PEG-5000浓度范围为0-20% (w/v)。

3.1. BSA-PEG溶液的LLPS热力学表征

通过浊度实验发现，纯BSA溶液在整个温度范围内（5-40°C）均无相分离，而添加PEG后则出现浓度依赖的相变：PEG浓度为7%时，相变起始温度为10°C；浓度升至10%时，相变温度提高至30°C。光学显微镜图像直观显示，10°C时BSA液滴呈球形且尺寸较大（平均直径9.4±2.4μm），20°C时减小至3.8±1.9μm，40°C时液滴完全溶解。这表明PEG作为分子拥挤剂通过减少可用体积促进蛋白自组装，而温度升高则逆向破坏液滴稳定性。

3.2. ATR-FTIR揭示BSA液滴沉积动力学

红外光谱时间序列分析显示，在8°C条件下，含10% PEG的BSA样品其酰胺I带（1653 cm^-1）强度随时间显著增加，60分钟内增幅达50倍，对应液滴沉积过程；而无PEG的对照组信号稳定。通过指数拟合沉积动力学曲线，发现PEG浓度越高，沉积时间常数越短（10% PEG时τ=9.9±0.6分钟），表明液滴数量和尺寸随拥挤度增加。基于Lambert-Beer定律，通过酰胺I带强度对比估算出液滴内蛋白浓度约为5mM，是初始溶液（100μM）的50倍。

3.3. 均相与凝聚相中BSA二级结构对比

归一化酰胺I带光谱及其二阶导数分析表明，均相（初始时间）与凝聚相（沉积60分钟后）的BSA二级结构无显著差异：主峰位于1655 cm^-1（α-螺旋），次要成分包括1614/1628 cm^-1（β-折叠）和1680 cm^-1（β-转角）。温度扫描实验进一步证实，当温度升至41°C时，酰胺I强度下降25%，与液滴溶解过程一致，但二级结构仍保持稳定。

该研究系统阐明了温度与PEG浓度对BSA的LLPS行为的协同调控规律，证实液滴形成无需蛋白构象改变，并建立了基于ATR-FTIR的无标记液滴浓度定量方法。这一策略为病理相关LLPS研究（如异常蛋白凝聚导致疾病）提供了新技术视角，尤其在实时监测、浓度定量和结构完整性验证方面具有突出优势。未来可拓展至其他生物分子体系，助力LLPS在生理与病理机制中的功能解析。