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本研究针对老龄化社会中对牙种植修复及牙槽骨增量日益增长的需求，开发了一种新型可注射热敏性水凝胶。研究人员利用墨鱼骨衍生的纳米羟基磷灰石（CB-nHA）和槲皮素（QT）负载的碳酸钙（CaCO3-QT）微胶囊，与壳聚糖/胶原蛋白复合制备水凝胶，系统研究了不同CB-nHA浓度（0%-15%）和壳聚糖/胶原蛋白比例（7:1和14:1）对水凝胶性能的影响。结果表明，含5% CB-nHA和1% CaCO3-QT的7:1壳聚糖/胶原蛋白水凝胶具有最优的注射性、孔隙结构（116±47μm）和生物活性，能显著提高封装人胎儿成骨细胞（hFOB）的活性和碱性磷酸酶（ALP）活性（p<0.05），为骨组织工程提供了具有临床应用潜力的新型生物材料。
随着老龄化社会的到来，牙种植修复的需求日益增长，牙槽骨增量手术也变得愈发重要。然而，传统的自体骨移植存在供骨量有限、老年人骨再生能力下降等问题，迫切需要开发新型的骨替代材料。理想的骨修复材料不仅要具有良好的生物相容性和骨传导性，还应具备可注射性，以实现微创手术，降低手术风险，特别适合身体状况较差的老年患者。
在这一背景下，生物材料的研究聚焦于模拟天然骨基质的成分和结构。壳聚糖（chitosan）和胶原蛋白（collagen）是两种天然生物聚合物，它们具有良好的生物相容性和生物可降解性，能够形成三维网络结构的水凝胶，为细胞提供附着和生长的支架。然而，单纯的壳聚糖/胶原蛋白水凝胶存在机械强度低、降解过快等局限性。为了克服这些缺点，研究人员常引入钙磷基材料，如羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA），以增强其力学性能和骨传导性。
与此同时，可持续发展的理念推动着对农业和海洋废弃物的再利用。墨鱼骨（cuttlebone）是鱿鱼的脊骨，是一种富含碳酸钙（CaCO3）和微量元素的海洋废弃物。通过水热法等处理，墨鱼骨可以转化为纳米羟基磷灰石（nanohydroxyapatite, nHA）颗粒（CB-nHA），其化学成分与骨中的羟基磷灰石相似，是一种天然、成本效益高的骨再生材料来源。
此外，天然抗氧化剂槲皮素（quercetin, QT）是一种广泛存在于水果蔬菜中的黄酮类化合物，具有促进成骨分化和减少氧化应激的潜力。但QT是疏水性分子，不稳定，需要合适的载体来实现其在体内的可控释放。碳酸钙（CaCO3）微胶囊作为一种生物相容性良好的材料，可以作为QT的储存和控释载体。
基于以上考虑，泰国Thammasat大学的研究团队在《Biochemistry and Biophysics Reports》上发表了一项研究，他们成功开发了一种载有墨鱼骨源纳米羟基磷灰石（CB-nHA）和槲皮素（QT）的碳酸钙微胶囊（CaCO3-QT）的热敏性可注射壳聚糖/胶原蛋白水凝胶，并系统评估了其物理性能、流变特性、注射性以及封装人胎儿成骨细胞（hFOB）后的生物活性和成骨分化潜能，旨在为骨组织工程提供一种新型的多功能生物材料。
为开展本研究，作者团队运用了几个关键的技术方法：首先，通过水热法合成墨鱼骨衍生的纳米羟基磷灰石（CB-nHA），并利用透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和动态光散射（DLS）对其进行表征；其次，采用直接沉淀法制备了负载槲皮素的碳酸钙（CaCO3-QT）微胶囊，并测定了其包封效率和释放 profile；最后，构建了不同CB-nHA浓度（0%、5%、10%、15%）和壳聚糖/胶原蛋白比例（7:1和14:1）的热敏性水凝胶，并对其微观结构、力学性能、流变特性、注射性、溶胀和降解行为进行了全面测试。细胞实验使用了商业来源（ATCC）的人胎儿成骨细胞（hFOB）进行封装培养，通过活/死细胞染色、细胞毒性试验（MTT法）和碱性磷酸酶（ALP）活性测定来评估其生物相容性和成骨诱导能力。
3.1. Properties of the cuttlebone derived nano hydroxyapatite-calcium carbonate microcapsule-chitosan/collagen hydrogels
3.1.1. Properties and microstructure of the hydrogels
扫描电镜（SEM）分析显示，水凝胶的孔隙结构受壳聚糖/胶原蛋白比例和CB-nHA浓度的显著影响。在0% CB-nHA组中，7:1和14:1比例的水凝胶孔隙最大，分别为279±71μm和317±49μm。增加CB-nHA浓度会减小孔隙尺寸和连通性，特别是在14:1组中更为明显。在7:1组中，5%、10%、15% CB-nHA的平均孔径分别为116±46μm、87±29μm和62±16μm，无显著差异。而14:1组的孔径则显著减小（43.7±9.2μm, 32.6±8.1μm, 20.3±5.5μm）。基于其良好的孔隙结构（116±47μm）和连通性，含5% CB-nHA的7:1壳聚糖/胶原蛋白水凝胶被选用于后续细胞实验。所有水凝胶均表现出热敏性，在37°C下12-15分钟内发生溶胶-凝胶转变，pH值在7.5±0.3之间。
3.1.2. Mechanical strength
单轴压缩测试表明，增加壳聚糖含量和CB-nHA浓度（5%-15%）并未显著增强水凝胶的机械强度（p>0.05）。在14:1组中，10% CB-nHA的机械强度显著高于0%和5% CB-nHA组，也高于7:1组中的10% CB-nHA配方（p<0.05）。在7:1组中，5% CB-nHA表现出最高的强度，与14:1组中的10% CB-nHA配方无显著差异。
3.1.3. Swelling degree
在PBS中浸泡24小时后，0%和5% CB-nHA组的水凝胶溶胀指数相似（平均4.8±1.8%），而10%和15% CB-nHA组的重量增加显著更低（p<0.05）。14:1配方的溶胀度也显著低于7:1配方。
3.1.4. Degradation degree
在溶菌酶溶液中，水凝胶的重量损失百分比随着CB-nHA浓度的增加而显著降低，特别是在14:1壳聚糖/胶原蛋白比例下（p<0.05）。在第11和14天，0% CB-nHA组的降解率显著高于其他组（p<0.05）。在7:1组中，5% CB-nHA在7-14天间的降解率显著高于10%和15% CB-nHA组（p<0.05），但与0% CB-nHA组无显著差异。在14:1组中，5%-15% CB-nHA的降解率相似且始终低于0% CB-nHA组。
3.2. Properties of calcium carbonate-quercetin microcapsules
3.2.1. Microstructure and quercetin encapsulation and release of the microcapsules
SEM显示CaCO3-QT微胶囊呈圆形，表面粗糙多孔，平均尺寸（5.5±0.7mm）显著大于不含QT的微胶囊（4.8±0.7mm）（p<0.01）。QT的包封效率（EE%）为71.84±1.4%，负载效率（LC%）为0.44±0.1%。在14天的释放实验中，CaCO3-QT持续释放QT，累计释放10.40±0.22%的包封QT，其中在1小时和3小时释放最快。预孵育了微胶囊的培养基中培养的hFOB细胞活力超过80%，而CaCO3组和游离QT对照组的体外矿化水平显著高于CaCO3-QT组（p<0.01）。
3.2.2. Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy and X-ray diffraction (XRD) analyses of the microcapsules
FTIR和XRD分析证实了CaCO3微胶囊的成功合成，并以方解石（vaterite）相为主。由于QT负载量低且被封装在CaCO3基质中，在CaCO3-QT的光谱中未观察到QT的特征峰。
3.3. Rheological characterization of hydrogels
流变学分析表明，所有水凝胶在低应变下均表现出线性粘弹性区域（LVR），具有固体样行为（G' > G''）。15% CB-nHA样品的存储模量（G'）和损耗模量（G''）显著增加，表明网络刚性增强，但同时也表现出更脆的特性，应变耐受性较低。5%和10% CB-nHA样品的G'相对于0% CB-nHA有所降低。所有样品均表现出剪切稀化行为。15% CB-nHA样品在低剪切速率下粘度最高，但在较高剪切速率下无法准确测量。0%-10% CB-nHA样品表现出较低且相似的剪切粘度曲线，具有更好的流动一致性。
3.4. Injectability test
注射性测试显示，注射力受CB-nHA浓度显著影响。15% CB-nHA需要最高的注射力（6.42±0.22 N），并且在注射过程中出现第二个平台期。0%-10% CB-nHA水凝胶在平台期的注射力保持一致（平均5.12±0.60 N），且显著低于15%组（p<0.05）。
3.5. Cell cytotoxicity and functionality of the hydrogel
3.5.1. Live/dead cell staining and cell viability assays
活/死细胞染色显示，封装在0% CB-nHA-CaCO3、5% CB-nHA-CaCO3、0% CB-nHA-CaCO3-QT和5% CB-nHA-CaCO3-QT水凝胶中的hFOB细胞均表现出高活力（绿色荧光），细胞有效粘附在水凝胶基质上并延伸出细胞质突起，形成三维细胞间连接。细胞毒性试验进一步证实，与含CaCO3和CaCO3-QT水凝胶预孵育的培养基中，细胞活力百分比均超过95%（与常规生长培养基对照组相比）。但第1天CaCO3-QT预孵育培养基的细胞活力（85%）显著低于对照组（p<0.05）。
3.5.2. Hydrogel cell encapsulation and osteogenic differentiation potential
碱性磷酸酶（ALP）活性测定表明，5% CB-nHA含CaCO3的水凝胶（5% CB-nHA-CaCO3）的ALP活性显著高于0% CB-nHA组（0% CB-nHA-CaCO3）（p<0.05）。而含有CaCO3-QT的水凝胶（0% nHA-CaCO3-QT和5% nHA-CaCO3-QT）的ALP活性无显著差异，但均显著高于其对应的只含CaCO3的组（p<0.01）。
研究表明，将农业废弃物衍生的骨替代材料CB-nHA与天然黄酮类化合物QT结合，可以作为替代性生物活性材料，显著增强水凝胶的注射性和骨传导性能。结论指出，CB-nHA和CaCO3-QT增强了可注射水凝胶的骨传导特性。由5% CB-nHA、1% CaCO3-QT和7:1壳聚糖/胶原蛋白比例组成的热敏性水凝胶，是一种具有生物活性的、可注射的载体，可用于携带成骨细胞和QT，以增强骨再生。这种水凝胶因其注射性、溶胀和降解行为以及尺寸稳定性，成为治疗骨骼缺损的合适骨替代材料，尤其适用于邻近关键神经出口的安全部位。未来的研究将在动物模型中进一步探讨其在骨缺损再生中的应用潜力。该研究不仅为开发新型骨修复材料提供了新思路，也体现了利用天然废弃物进行可持续生物材料开发的环保理念。
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