细胞外腺苷通过远程调控AMPK信号通路控制果蝇组织生长的机制研究

本研究揭示了果蝇发育过程中，蜕皮激素和膳食蛋白通过调控肠道腺苷脱氨酶表达，影响循环腺苷水平，进而远程控制AMPK活性并调节组织生长的全新机制。研究人员发现循环腺苷进入细胞后经磷酸化生成AMP，激活AMPK-mTORC1通路，最终调控器官生长速率，这为理解代谢信号远程调控组织生长提供了新视角。

在生物发育过程中，器官如何精确控制其生长速率和最终大小一直是发育生物学的核心问题。果蝇作为模式生物，其翅膀发育过程为研究器官生长调控提供了理想模型。翅膀从胚胎期的30个细胞发育到幼虫末期约5万个细胞，这一过程受到多种信号通路的精密调控。传统观点认为AMP激活的蛋白激酶(AMPK)主要作为应激激活激酶，在细胞能量匮乏时通过感知AMP水平来激活 catabolism（分解代谢）途径。然而，这项发表在《Nature Cell Biology》的研究揭示了AMPK调控的全新机制——它不仅能被细胞内的能量状态激活，还能被一种发育信号代谢物远程调控。

研究人员在研究果蝇器官生长时意外发现，两个已知调节器官生长速率的生理输入信号——蜕皮激素(ecdysone)和膳食蛋白，竟然通过调控肠道腺苷脱氨酶表达来影响循环腺苷水平。这种细胞外腺苷作为信号分子进入细胞后，被磷酸化为AMP从而激活AMPK，最终抑制器官生长。这一发现表明AMPK活性不仅受应激调节，还能被发育信号调控，且一个组织中的AMPK活性可以通过循环腺苷被另一个组织远程控制。值得注意的是，这种机制解释了膳食蛋白对果蝇组织生长速率影响的50%。

为了开展这项研究，研究人员采用了多种关键技术方法：利用温度敏感的GAL80ts系统实现时空可控的基因表达调控；通过LexA/LexAop和GAL4-UAS系统进行组织特异性基因操作；使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色检测细胞增殖；采用RNA测序技术分析基因表达谱；通过免疫印迹检测AMPK和mTORC1信号通路活性；使用腺苷测定试剂盒定量循环腺苷水平；以及体外培养技术进行翅膀盘片外植体实验。

Ecdysone autonomously promotes wing proliferation and non-autonomously represses it

研究人员首先建立了时空可控的蜕皮激素信号操纵系统。通过使用温度敏感的GAL80ts系统，在幼虫第三龄期(L3)初期条件性敲低蜕皮激素生物合成所需的spookier(spok)基因，发现翅膀盘片在48小时后停止增殖。当仅在翅膀中敲低蜕皮激素受体EcR时，即使动物其他组织缺乏蜕皮激素信号，翅膀盘片仍能持续增殖。然而，当在所有组织中普遍敲低EcR或通过喂食20-羟基蜕皮激素(20E)普遍激活蜕皮激素信号时，翅膀盘片仅在增殖48小时后就在96小时停止增殖。这种差异表明蜕皮激素在翅膀以外的组织中非自主性地导致翅膀盘片在96小时停止增殖。

Ecdysone signalling inhibits wing proliferation via intestinal enterocytes

为了鉴定蜕皮激素抑制翅膀增殖的其他组织，研究人员筛选了在不同组织中表达GAL4的驱动剂系列。结果表明，只有使用肠道特异性驱动剂drm-GAL4敲低EcR才能导致翅膀盘片在96小时停止增殖。进一步实验发现，肠道肠上皮细胞中的EcR敲低足以引起翅膀增殖终止，而其他细胞类型如肠内分泌细胞、肠母细胞或干细胞则无此效应。这表明蜕皮激素对翅膀盘片增殖具有双重作用：一方面自主促进翅膀细胞增殖，另一方面通过作用于肠道肠上皮细胞非自主抑制翅膀增殖。

Ecdysone signalling inhibits wing proliferation by inhibiting Adgf-A expression in intestinal enterocytes

通过RNA测序分析，研究人员发现蜕皮激素信号调控肠上皮细胞中腺苷脱氨酶相关生长因子Adgf-A的表达。Adgf-A是一种主要在肠道表达并分泌到循环系统中的腺苷脱氨酶，能将腺苷转化为肌苷，从而从循环中清除腺苷。实验证实蜕皮激素信号通过降低肠道Adgf-A表达，导致循环腺苷水平增加，进而抑制翅膀增殖。过表达Adgf-A能够挽救由蜕皮激素信号引起的翅膀增殖停止，表明Adgf-A是蜕皮激素下游负责抑制翅膀生长的靶基因。

Circulating adenosine is converted to AMP to inhibit wing proliferation

研究人员进一步探索循环腺苷如何抑制翅膀盘片增殖。实验发现，敲低细胞表面腺苷受体(AdoR)不能挽救翅膀增殖终止，而敲低腺苷激酶Adk2和Adk3则能够挽救增殖抑制。这表明循环腺苷需要进入翅膀盘片细胞，通过Adk2/3转化为AMP来抑制翅膀增殖。与此一致的是，翅膀盘片中的AMP水平在96小时比48小时增加，而敲低Adk2/3能够逆转这种增加。

Circulating adenosine activates AMPK in the wing disc

实验证明循环腺苷被转化为AMP后能够激活翅膀盘片中的AMPK。普遍激活EcR信号（导致腺苷水平升高）引起翅膀盘中AMPK活性升高；降低或增加循环腺苷水平相应地减少或增加翅膀盘中AMPK活性；在翅膀盘中特异性敲低Adk2/3导致AMPK活性降低。这些结果表明AMPK的激活需要腺苷向AMP的转化，且翅膀盘中的AMPK活性被肠道"远程控制"。

Circulating adenosine inhibits wing proliferation via AMPK

通过翅膀盘片外植体培养实验，研究人员证实腺苷通过激活AMPK抑制翅膀增殖。在缺乏腺苷脱氨酶的情况下，野生型翅膀盘片停止增殖，而AMPK敲低的翅膀盘片仍能增殖。在体内实验中，敲低翅膀中的AMPK能够使本应在96小时停止增殖的盘片继续增殖，表明AMPK激活是导致翅膀盘片停止增殖的原因。

Circulating adenosine inhibits mTORC1to inhibit wing proliferation

由于AMPK抑制mTORC1，研究人员检测了mTORC1活性。所有操作显示，降低或增加循环腺苷水平分别导致翅膀盘mTORC1活性增加或减少。激活mTORC1能够使翅膀盘继续增殖，而抑制mTORC1则逆转由AMPK敲低引起的增殖，表明mTORC1在AMPK下游调控增殖。

Adenosine levels are regulated in development

在发育过程中，蜕皮激素滴度振荡变化，在幼虫阶段转换时达到峰值。研究发现Adgf-A表达在L3中期当蜕皮激素滴度低时达到峰值，而在游走L3期当蜕皮激素滴度增加时降低。腺苷水平在化蛹后0和24小时增加，与Adgf-A水平下降相比略有延迟。

Adenosine regulates growth rate and mildly affects final organism size

降低循环腺苷水平使幼虫生长更快、体型更大，且化蛹更快。内源性腺苷减缓生长和发育速率。成虫翅膀大小也受腺苷信号通路活性的调节，敲低AMPK或Adk2+Adk3导致成虫翅膀更大。

Dietary yeast regulates developmental rate in part via adenosine

研究发现膳食酵母通过GCN2-ATF4通路调节肠道Adgf-A表达，且这种感应不依赖于蜕皮激素信号或mTORC1。膳食酵母通过调节腺苷水平影响发育速率，低酵母饮食引起的发育延迟部分是由于腺苷水平升高所致。

Dietary adenosine regulates growth

膳食腺苷激活翅膀中的AMPK并抑制mTORC1，导致动物化蛹速率显著延迟。这不是由于对蜕皮激素信号的直接影响，而是通过AMPK-mTORC1通路调控生长。

研究结论表明，蜕皮激素信号和膳食蛋白通过控制肠道肠上皮细胞中Adgf-A表达来调节翅膀生长，这影响了循环腺苷水平，腺苷进入翅膀等组织后被转化为AMP，激活AMPK从而抑制翅膀增殖。这一发现从三个方面拓展了我们对AMPK的理解：首先，AMPK可以被发育信号代谢物腺苷激活，而不只是应激信号；其次，AMPK感知的不是细胞内信号，而是由身体其他组织产生的外部信号；最后，AMPK具有调节器官生长速率的新生理功能。

该研究的重要意义在于揭示了循环腺苷作为信号分子整合多种输入信号（蜕皮激素水平、膳食酵母水平和膳食腺苷水平）来调节发育生长速率的新机制。腺苷与胰岛素共同构成调节系统：胰岛素促进组织生长，而腺苷抑制组织生长。这种机制可能代表生物系统使用营养感应通路的保守方式，通过比实际需要更 drastically地下调细胞代谢来确保细胞不会遭遇可能导致细胞死亡的代谢灾难。

此外，蜕皮激素对翅膀生长的双重影响为器官大小控制提供了新见解：自主分支一次影响一个器官，可能影响器官的相对比例；而非自主分支平等影响所有器官，调节整体动物的生长速率。由于非自主抑制分支存在时间延迟，每次蜕皮激素峰值可能允许器官进行离散量的生长，这为理解蜕皮激素如何影响组织生长增加了时间维度上的复杂性。

这项研究不仅深化了我们对器官大小和生长速率调控机制的理解，也为代谢疾病、癌症和神经退行性疾病等与AMPK异常活性相关的疾病提供了新的研究视角。