长链非编码RNA LOC645166通过miR-188-5p/NFKBID轴调控强直性脊柱炎患者T细胞中FOXP3表达的作用机制研究

本综述深入探讨了长链非编码RNA（LncRNA）LOC645166在强直性脊柱炎（AS）发病机制中的关键作用。研究发现，LOC645166通过吸附miR-188-5p，解除其对NF-κB抑制剂D（NFKBID，亦称IκBNS）的抑制作用，进而促进FOXP3的表达和调节性T细胞（Treg）分化。LOC645166的下调导致miR-188-5p水平升高，抑制NFKBID，最终削弱Treg功能，加剧自身免疫反应。该轴为AS的免疫治疗提供了新的潜在靶点。

1. 引言

强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis, AS）是一种以脊柱关节慢性炎症为特征的关节炎性疾病，部分患者随病情进展会出现脊柱融合、强直和韧带骨赘形成。遗传因素如HLA-B27基因携带显著增加AS患病风险，但仅有1%–2%的HLA-B27阳性人群会发病，提示其他遗传或环境因素也参与疾病发生。

长链非编码RNA（LncRNAs）是长度超过200个碱基的转录本，虽不编码蛋白质，但可通过表观遗传、转录及转录后调控等方式调节基因表达。近年研究表明，LncRNAs在AS发病中扮演重要角色，其表达失调可促进促炎细胞因子信号的上调及IL-23/IL-17轴活性增强，进而加剧炎症和异常骨形成。

近期研究发现，LOC645166在AS患者T细胞中表达下调。过表达LOC645166可抑制Jurkat细胞或AS患者T细胞中STAT3的活化，其机制在于LOC645166优先结合K63连接的多聚泛素链，阻断IKK复合物与这些链的结合，从而抑制IKK2的活化。IKK2的激活对NF-κB信号通路的启动至关重要。NF-κB与IκBs形成无活性复合物存在于细胞质中，活化的IKK2磷酸化IκBs，导致其经K48连接的多聚泛素化修饰后被蛋白酶体降解，NF-κB得以入核调控靶基因表达。因此，LOC645166的下调增强了AS患者T细胞对促炎细胞因子或TLR配体刺激的NF-κB信号敏感性。

调节性T细胞（Treg）是免疫系统的重要调节者，维持自身抗原耐受和免疫稳态。Treg分为诱导型Treg（iTreg）和天然Treg（nTreg），分别来自外周淋巴组织和胸腺。Treg的特征是表达CD4、CD25和叉头盒蛋白P3（FOXP3）。FOXP3是调控Treg细胞发育和表型维持的关键转录因子。研究表明，nTreg和iTreg细胞的发育均受NF-κB信号驱动。NF-κB直接结合FOXP3基因座的启动子、CNS2和CNS3区域，促进FOXP3表达。NF-κB抑制剂D（NFKBID，即IκB_NS）作为非典型IκB蛋白，在NF-κB信号激活下对FOXP3表达的调控起关键作用。NFKBID与NF-κB转录因子（如p50或c-Rel）结合，共同作用于FOXP3基因座的启动子和CNS3区域，增强FOXP3表达，进而介导Treg细胞发育。NFKBID在NF-κB信号激活后稳定表达，不被蛋白酶体降解。

本研究旨在探索LOC645166在AS发病中的生物学功能，重点研究LOC645166/miR-188-5p/NFKBID相互作用网络在AS患者T细胞中的存在及其对FOXP3表达的调控作用。

2. 材料与方法

2.1. 材料

实验所用化学试剂如丙烯酰胺、双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、Tris碱、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、SDS、甘氨酸、NP-40等购自Sigma-Aldrich。抗体包括抗CD3、抗CD28、抗actin、抗NFKBID和抗FOXP3购自Cell Signaling Technology。miR-188-5p、模拟阴性对照、miR-188-5p抑制剂及抑制剂阴性对照购自Thermo Fisher Scientific。

2.2. 定量RT-PCR检测miR-188-5p和NFKBID mRNA

从AS患者和健康对照者分离PBMCs、T细胞或总RNA，方法如前述。miR-188-5p和NFKBID mRNA的定量分别参照Yang等和Hirotani等的方法。U6作为miR-188-5p的内参，β-actin作为NFKBID mRNA的内参。引物序列如下：miR-188-5p正向：5′- CCC TCT CTC ACA TCC CTT GCA T -3′，反向：5′- ATC CTG CAA ACC CTG CAT GTG -3′；U6正向：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CAT ATA CT-3′，反向：5′-ACG CTT CAC GAA TTT GCG TGTC-3′；NFKBID正向：5′-GCT GTA TCC TGA GCC TTC CCT GTC-3′，反向：5′-GCT CAG CAG GTC TTC CAC AAT CAG-3′；β-actin正向：5′-CTA TGT GGG TGA CGA GGC CCA GAG-3′，反向：5′-GGG TAC ATG GTG GTA CCA CCA GAC-3′。相对表达比采用2^−ΔΔCq法计算。

2.3. LOC645166过表达对miR-188-5p或LOC645166水平的影响

构建pcDNA3.1-LOC645166载体，通过电穿孔法转染Jurkat细胞（1.5×10⁶个细胞）1μg载体或空载体，方法如Yu等所述。转染24小时后收集细胞，定量检测miR-188-5p和LOC645166水平。

2.4. miRNA共免疫沉淀

使用miRNA Target IP kit（Active Motif）进行miRNA IP。Jurkat细胞（3×10⁶个）接种于10cm培养皿，培养过夜后电转染miR-188-5p（5μM）。转染24小时后，用抗Ago1/2/3抗体免疫沉淀RISC复合物，沉淀产物中的LOC645166和NFKBID mRNA通过qRT-PCR分析。

2.5. Western Blotting

Jurkat细胞（1.5×10⁶个）电转染pcDNA3.1-LOC645166（1μg）、miR-188-5p（5μM）或miR-188-5p抑制剂（5μM）。转染后细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养48小时，收集细胞，重悬于1% SDS并超声破碎。取50μg裂解液进行Western blotting，检测actin或NFKBID。为检测FOXP3表达，转染细胞用PMA（20ng/mL）和离子霉素（500ng/mL）激活48小时，Western blotting检测FOXP3。分析AS患者和健康对照T细胞或CD4⁺ T细胞中NFKBID或FOXP3蛋白水平，方法类似。为研究NFKBID对FOXP3表达的影响，用siRNA（sc-97928, Santa Cruz Biotechnology）敲低Jurkat细胞中NFKBID mRNA，电转染siRNA（1μg）后激活细胞，Western blotting检测NFKBID和FOXP3。

2.6. 流式细胞术

从AS患者和健康对照PBMCs分离CD4⁺ T细胞，用BB515标记的抗人CD25抗体（BD Life Sciences）染色30分钟，洗涤后固定和透化（Human FOXP3 Buffer Set, BD），再用PE标记的抗人FOXP3单抗染色30分钟，洗涤后流式细胞术分析。

2.7. 伦理声明

AS患者根据修订的纽约标准定义。所有参与者来自佛教大林慈济医院（台湾嘉义），时间从2021年8月至2023年7月，签署知情同意书，研究方案经机构审查委员会和伦理委员会（IRBEC）批准（批准号：B11003004）。AS患者基本信息见支持信息表。

2.8. 统计分析

数据以均值±标准差表示，至少三次独立实验。采用Mann–Whitney U检验分析统计学显著性，设定p<0.05。

3. 结果

3.1. LOC645166/miR-188-5p/NFKBID相互作用网络的鉴定

LncRNAs可作为海绵吸附miRNAs，阻断miRNA与其靶mRNA的结合，从而调节细胞功能。本研究聚焦于LOC645166相关miRNAs，这些miRNAs可能调节炎症和免疫反应。通过lncRABKB网站搜索，发现多个LOC645166相关miRNAs，包括miR-188-5p、hsa-miR-924等。其中，miR-188-5p因可能调节免疫反应和炎症而引人关注。LOC645166与miR-188-5p的结合位点及miR-188-5p与NFKBID mRNA 3′-UTR的靶向关系经实验验证。Jurkat细胞转染miR-188-5p后，抗Ago1/2/3抗体免疫沉淀显示RISC复合物中LOC645166和NFKBID mRNA水平增加，表明两者均为miR-188-5p靶标。与健康对照相比，AS患者T细胞中LOC645166表达下调，miR-188-5p水平升高，NFKBID蛋白水平降低。

3.2. LOC645166过表达抑制miR-188-5p表达并促进NFKBID产生

LOC645166过表达显著降低miR-188-5p水平，上调NFKBID蛋白表达。miR-188-5p过表达则抑制NFKBID产生。共转染LOC645166和miR-188-5p可逆转NFKBID的上调，证实miR-188-5p靶向NFKBID mRNA。

3.3. miR-188-5p抑制剂处理增强NFKBID蛋白表达

转染miR-188-5p抑制剂可降低miR-188-5p水平，但不影响LOC645166表达；同时，NFKBID蛋白表达增加。

3.4. FOXP3表达受LOC645166/miR-188-5p/NFKBID轴调控

LOC645166过表达促进FOXP3表达；miR-188-5p过表达抑制FOXP3，而其抑制剂可逆转此效应。NFKBID过表达上调FOXP3，敲低则抑制FOXP3表达，表明该轴调控FOXP3。

3.5. AS患者T细胞中FOXP3表达下调和Treg细胞减少

AS患者T细胞中FOXP3蛋白水平显著低于健康对照。流式细胞术显示，AS患者CD4⁺ T细胞中Treg细胞（CD25⁺FOXP3⁺）频率明显降低。

4. 讨论

NF-κB信号通过促进FOXP3诱导正向调控Treg细胞发育。然而，AS作为慢性炎症性疾病，虽NF-κB活性增强，但FOXP3诱导和Treg发育受抑制。本研究发现，LOC645166下调通过上调miR-188-5p、抑制NFKBID，进而阻碍FOXP3表达和Treg发育。LOC645166作为蛋白海绵结合K63泛素链，抑制IKK2活化，负调NF-κB信号；同时作为miRNA海绵吸附miR-188-5p，解除对NFKBID的抑制，正调FOXP3。LOC645166下调导致AS患者T细胞中NF-κB信号增强而FOXP3抑制，解释为何Treg减少尽管NF-κB活性高。

Treg细胞通过抑制效应T细胞活化和增殖维持免疫耐受。FOXP3是Treg发育和功能的关键调节者，其突变导致严重自身免疫病。NF-κB信号在TCR engagement期间激活，通过CBM复合物和K63泛素链招募TAK1-TAB2/3和IKK复合物，活化IKK2，启动NF-κB信号，促进FOXP3表达。LOC645166下调虽增强TCR介导的NF-κB信号，但通过miR-188-5p/NFKBID轴抑制FOXP3诱导，表明LOC645166通过不同途径同时调节炎症反应和免疫应答。

Guo等也发现活动期AS患者Treg细胞中FOXP3蛋白减少，关联CNS2高甲基化和IL-2信号异常，削弱Treg功能，促进AS发病。

5. 结论

LOC645166/miR-188-5p/NFKBID相互作用轴存在于AS患者T细胞中。LOC645166下调导致miR-188-5p水平升高，抑制NFKBID表达，进而阻碍FOXP3诱导和Treg细胞发育，这为AS的免疫治疗提供了新靶点。