摘要
本研究成功开发了一种纳米尺寸的合成皂石粘土水凝胶（LAP），该凝胶能够实现可控的氧气输送，因此在治疗皮肤伤口感染和促进愈合方面展现出广阔前景。LAP作为一种合成纳米材料，由尺寸小于100纳米的氧化铝（Al2O3）颗粒组成，具有高度有序的层状（皂石）结构。研究人员通过掺入过氧化钙（CPO）作为释氧剂，系统评估了LAP水凝胶的抗菌效果。结果表明，含CPO的LAP水凝胶在最初五小时内表现出显著的氧气释放增加，尤其是在低CPO浓度下。例如，含有5% CPO的水凝胶显示出可控的释放曲线，5小时后的最终氧气释放百分比为2.47 ± 0.01%。相比之下，含有10%和20% CPO的水凝胶最终氧气释放值较低，分别为0.67 ± 0.01%和0.75 ± 0.01%，这表明LAP在较高浓度下的封装效率更高。研究还证实LAP本身是一种有效的氧气屏障，并显示出固有的抗菌活性。该水凝胶对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）均观察到抑菌圈，强调了其通过提供持续氧合和对抗微生物感染而作为有效伤口治疗工具的潜力。
1. 引言
伤口护理约占医疗总成本的3%，其中慢性伤口和二次愈合伤口是主要贡献者。在这些伤口中，微生物感染是伤口愈合的最大挑战之一。定植于伤口的微生物通常来源于患者的正常菌群，或可通过接触水、真菌或医护人员不洁的手传播。由于部分微生物对抗生素耐药，新的治疗方法有望降低成本并改善患者护理。
迄今为止，水凝胶被描述为伤口愈合的最佳敷料形式之一。它们具有类组织结构、生物相容性，可以控制体液流失和释放，并保持伤口区域的湿润和湿度。合成纳米尺寸的皂石氧化铝（LAP）易于在浓度超过2%重量比时形成水凝胶，因为它在水中表现出触变性。LAP具有高生物相容性、各向异性形态和大比表面积，这使得其在生物医学领域的众多应用得以改进。在皮肤化妆品领域，它也可用于皮肤保护以及作为粉末、乳膏和乳液中的成分。LAP还为递送治疗药物提供了一个可控平台，同时天然和合成粘土通过抗感染、管理湿度、止血和促进新组织生长而成为高效的伤口敷料。
开发能够可控产生氧气的水凝胶可以为防止缺血诱导的植入细胞死亡提供独特的解决方案。例如，Alemdar等人通过将不同浓度的过氧化钙（CPO）掺入甲基丙烯酰化明胶（GelMA）中制备了产氧水凝胶，发现基于CPO的氧气生成通过限制坏死来减少缺氧诱导的细胞死亡。在含有过氧化苯甲酰和LAP的藻酸盐 hydrogel 中，观察到恶性细胞增殖减少以及健康成纤维细胞存活率随之增加。这些结果表明，产氧水凝胶有潜力改善旨在再生缺血组织的组织工程策略。本研究首次将CPO以不同浓度引入LAP水凝胶，并研究了其杀菌效果，成功制备出一种可用于伤口愈合的杀菌凝胶。
2. 材料与方法
使用购自Southern Clay Products Inc.的合成硅酸盐纳米片（Laponite® XLG）制备水凝胶。LAP是一种纳米尺寸的合成皂石硅酸盐纳米材料，其特征是高度有序的层状结构，由通常小于100纳米的氧化铝（Al2O3）颗粒组成。通过将粘土粉末逐渐加入蒸馏水（9%重量比）中并机械搅拌制备LAP分散体。将作为产氧剂的CPO以不同浓度（0、5、10和20% 重量/重量比 于LAP中）加入，并在室温下通过磁力搅拌混合形成均质溶液。LAP片晶具有高亲水性和溶胀能力，其负表面电荷有利于与质子化和亲水性分子的强界面相互作用。该材料具有约60 meq/100 g的特定阳离子交换容量（CEC），这决定了其对治疗剂的最大负载能力。
在水性环境中，LAP表现出触变性，并在浓度超过2%重量比时易于形成水凝胶。所得的三维网络充当混合互穿基质，限制了带电颗粒之间的孔隙率，尽管水扩散通过内部孔结构得以维持。虽然粘土本身是有效的氧气屏障，但掺入过氧化钙（CPO）作为添加剂会调节水凝胶的孔隙率，CPO含量的增加对应于增强的氧气释放动力学。
使用PreSens光学传感器在缺氧环境下于36.5°C下测定LAP-CPO水凝胶的氧气释放动力学，持续6小时。制备直径为5毫米、厚度为4毫米的水凝胶样品。使用配备场发射枪的扫描电子显微镜（SEM）检查水凝胶的形态，样品在成像前冷冻干燥24小时并镀金60秒。
使用NanoMec50-Hsensor压缩测试仪以2毫米/分钟的应变速率测试水凝胶的可注射性。将制备的水凝胶填充到带有0.25毫米直径针头的10毫升注射器中。该测试对每个样品进行三次并报告平均值。
为进行抗菌测试，将大肠杆菌（E. coli, ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（S. aureus, ATCC 25923）在3% BHI肉汤中于37°C培养24小时。然后将细菌培养物在0.9%盐水中稀释至0.5麦氏浊度标准。
使用直接接触法测试水凝胶的抑制效果。将细菌拭子涂布在含有Mueller-Hinton培养基的平皿中。将每种水凝胶均匀涂布在载玻片上并与培养基直接接触。所有测试均进行三次。琼脂盘扩散试验是通过在施加细菌接种物后，将抗菌盘铺在琼脂平板上进行的。测量每个盘周围细菌生长抑制圈的直径（毫米）。
数据收集自五次不同的实验，并以平均值±标准差（SD）表示。使用GraphPad Prism© version 6.00软件，通过方差分析（1-way ANOVA）、Tukey多重比较检验以及Bartlett检验作为事后检验（p ≤ 0.05）分析统计差异。抑制圈直径的群体呈正态分布且各实验独立。使用Shapiro–Wilk检验分析数据的正态性。此外，使用Pearson相关系数确定抑制圈大小与水凝胶浓度之间的相关性。所有组在p ≤ 0.0001时进行比较，具有统计学显著差异。
3. 结果与讨论
冷冻干燥水凝胶的形态显示所有样品均表现出类似的层状结构，表明LAP片晶未完全剥离。随着CPO含量的增加，水凝胶变得更致密。这些结果表明LAP未在三维网络结构中发生交联。
氧气释放在缺氧和温度控制（36.5°C）条件下测量。根据方程式（1），O2的动力学释放模式为准一级，O2分数与时间成反比。速率随浓度n倍时间增加，这是由于CPO随H2O2增加而增加。此外，温度和pH等参数是形成过氧化氢（H2O2）和O2的原因。因此，在本研究中未使用过氧化氢酶作为介质来生成由方程式（2）形成的完全反应。但温度控制有助于O2形成；然而，结果对应于较低的O2值。
方程式（1）: CaO2+ H2O → Ca(OH)2↓ + 1/2 O2↑
方程式（2）: CaO2+ 2H2O → Ca(OH)2↓ + H2O2
“累积氧气释放”代表指定时间后的总氧气释放，“氧气释放”代表任何时间的氧气释放。点“零”表示未释放氧气。点“100%”表示总氧气释放。光学传感器测量的所有值均归一化为水百分比（11.890%）作为对照。4小时后，LAP-CPO（20.0%）达到其最大氧气释放，表明是一个饱和过程且氧气释放速率较低。然而，在LAP-CPO（5.0%）中，最初时刻显示出更可控的氧气释放，该释放在5小时后延长，并在此时显示2.47 ± 0.01%的氧气释放。LAP-CPO（10.0%）也显示出受控的氧气释放，但氧气释放百分比也较低，并且在5小时后达到最大释放，显示最小释放值为0.67 ± 0.01%。
这些结果证实，当CPO的增加未超过LAP的封装效率时，LAP中的CPO允许可控的氧气释放。例如，Adover等人合用了结冷胶（GG）与LAP作为缓释药物递送系统，表明LAP的存在显著减缓了亲水性药物的释放动力学，证实LAP可以成为制备缓释递送系统的有效添加剂。
从回归模型得出的决定系数（R²），LAP-CPO（5%）为0.84，LAP-CPO（10%）为0.80，LAP-CPO（20%）为0.72，证明了时间与氧气释放之间存在稳健的线性关系。具体而言，5%配方保持了最高的模型拟合度（R² = 0.84），确认当CPO浓度严格与粘土的负载能力对齐时，氧气释放保持高度一致。相比之下，10%和20%组的R²值下降反映了一旦超过这种矿物学饱和极限，封装效率降低和控制力减弱。这些高相关值强调，与可降解有机水凝胶中常观察到的指数释放相比，LAP-CPO系统为持续治疗递送提供了更可预测的平台。
Porion等人表明，粘土用于确定水分子的迁移率和水扩散。他们的结果证实由于存在的孔隙率导致水扩散。然而，LAP作为带电颗粒的基质，限制了颗粒之间的孔隙率。此外，CPO的添加有助于水凝胶的孔隙率，水凝胶中存在的CPO越多，氧气释放越高。在另一项研究中，Montesdeoca等人合成了负载0.5%、1%和3%重量/重量比CPO的GelMA水凝胶。他们的结果表明，3%的浓度允许更高的氧气释放，持续长达6天。因此，LAP作为水凝胶基质形成混合互穿网络，但在存在其他添加剂的情况下，添加的纳米颗粒可以通过孔隙释放。Tritschler等人使用LAP作为氧气屏障的聚合物，结果表明LAP有效地充当了屏障。释放时间直接取决于配方中LAP的含量（浓度）。
本研究的结果与先前的一份手稿进行了比较，该手稿考虑了氧气释放的两个变量（时间和CPO浓度）。先前报道的GelMA-CPO水凝胶的氧气释放在第一天为9.83 ± 0.30%、10.09 ± 0.30%和52.33 ± 1.57%。在剩余几天观察到下降。将此处呈现的结果与先前报道的结果进行的整体分析显示，GelMA水凝胶的氧气释放在较低CPO浓度下保持恒定，在较高浓度（3%）下降低。
这些生物材料之间的差异是预期的，原因是LAP和聚合物具有不同的扩散系数。当聚醚醚酮（PEEK）、聚乳酸（PLA）和聚乙烯醇（PVA）暴露于温度时，液体可以通过孔隙渗透，由于聚合物的化学和物理性质以及降解过程，释放增加。GelMA也是如此；当水通过孔隙渗透并允许化学反应和氧气释放时，降解开始，导致指数释放。
另一方面，LAP是一种粘土，可以在不受温度和亲水特性、浓度和药物浓度影响的情况下起到凝胶作用。LAP水凝胶表现出优于传统有机聚合物（如GelMA）的结构稳定性，主要是因为其矿物学特性使其能够保持凝胶完整性，而不受温度变化的影响。与随着水渗透其孔隙而经历快速降解的聚合物不同，LAP是一种合成皂石粘土，充当稳定的基质和有效的氧气屏障，提供更可控和持续的递送曲线。虽然物理结构保持坚固，但水凝胶的实验成功仍然高度依赖于添加剂的浓度；具体而言，氧气释放动力学受粘土的负载能力支配。当过氧化钙（CPO）含量保持在该材料的特定阳离子交换容量（约60 meq/100 g）内时，如5%浓度所见，它实现了优异的持续释放。然而，超过此限制（如10%和20%配方中所观察到的）会降低封装效率，并导致较低的最终氧气释放值。因此，虽然LAP基本上不受温度诱导降解的影响，但其性能仍然通过粘土基质的化学饱和极限精确调节。因此，扩散系数随时间增加，并为缓释药物提供了更好的曲线。这是由于LAP的特性，如高亲水性、溶胀能力和阳离子交换容量，其中质子化和亲水性药物分子与LAP的负表面显示出强界面相互作用。
此外，LAP粘土的存在有助于降低其他允许氧气完全释放的材料的降解速率，例如具有高粘土矿物含量的纳米复合材料（80:20），其中降解速率在48小时后降低了5.5%。在21天的时间内，LAP/聚环氧乙烷（PEO）与40%至70% LAP粘土含量的质量损失也从47%降至23%。同样重要的是要注意，高LAP含量将导致高度交联的薄膜网络，因为生物材料变得更具抵抗力。
然而，CPO浓度和药物浓度都会影响封装效率（EE）。LAP是一个主要因素，因为当药物浓度超过最大负载容量（约60 meq/100 g，这意味着100 g LAP最多可容纳1.38 g Na（Na分子量23 g/mol））时，EE降低。这就是为什么在10%重量/重量比和20%重量/重量比CPO在LAP中时，氧气释放减少，并且在10% CPO时在5小时后完全释放（0.67 ± 0.01）%，在20% CPO时在2小时后完全释放（0.75 ± 0.01）%。与5% CPO相比，氧气释放得到更好控制，因为它在5小时后仍不完全（2.47 ± 0.01）%。
因此，负载CPO纳米颗粒的两种水凝胶的全局线性拟合表明，所有样品均存在统计学显著关系：LAP-CPO（5%、10%和20%）显示p值分别为0.01、0.01和0.02。与先前报告显示类似结果相比，两种比较的水凝胶在时间和氧气释放之间存在完美的负相关线性下降。
LAP-CPO水凝胶的控氧释放与合成粘土的矿物学和物理化学性质内在相关。作为纳米尺寸的合成皂石硅酸盐，LAP提供高比表面积和各向异性形态，作为递送治疗药物的稳健平台。虽然已知LAP粘土基质限制颗粒之间的孔隙率，但掺入CPO作为添加剂为水凝胶结构引入了额外的孔隙率。这种矿物学排列允许水扩散，这对CPO产生氧气的化学反应至关重要。持续释放曲线受LAP的负载能力支配。当CPO浓度超过此最大值时，如在10%和20%重量/重量比配方中所观察到的，封装效率降低，导致与5%配方相比最终氧气释放值较低。与有机聚合物（如GelMA）不同，LAP保持稳定的凝胶结构，对温度变化和亲水降解较不敏感。LAP的层状皂石结构作为有效的氧气屏障，减缓释放动力学，并提供更可控、持续的递送曲线。
可注射性测试检查了水凝胶通过针头和注射器的流动情况。这对于评估水凝胶对不同应用的性能和适用性可能起关键作用。所有产生的水凝胶的粘度随时间增加。这种行为持续到达到平衡状态，并且水凝胶像牛顿分子一样行为，具有恒定粘度。CPO的存在减少了LAP片层（如图1所见）。
菌落计数用于分析材料抑制或减缓病原菌生长的程度。在所有LAP-CPO水凝胶中均观察到抑菌圈的形成。Vishnuvarthanan和Rajeswari也表明，添加LAP显著改善了对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性，并增加了抗菌屏障性能。水凝胶敷料具有热绝缘体，可创造强大的抗菌环境，对伤口病原体不可渗透，并进一步保护伤口免受外部污染。
Akhavan-Kharazian和Izadi-Vasafi研究了CPO在基于壳聚糖和明胶的聚合物薄膜中的效果。他们还表明，向薄膜组合物中添加CPO增加了针对大肠杆菌（E. coli）的薄膜的抗菌活性。氧气释放在第一天达到峰值，并在随后的7天内逐渐接近恒定值。
使用LAP作为对照的扩散试验是为了确保水凝胶的抗菌活性不受LAP影响。每个盘周围细菌生长抑制圈的直径与细菌样本的敏感性以及抗菌剂在琼脂中的扩散速率有关。水凝胶产生的抑制圈大小的最高平均值在5%和10%浓度下获得（针对金黄色葡萄球菌，S. aureus）。然而，在最高的CaO2浓度下，观察到晕圈减少。很可能是因为圆盘吸收了CaO2，使其难以释放到培养基中。
这一结果表明，可能是外膜被ROS裂解，造成了可能导致微生物裂解的损伤。诱导细胞损伤的最有效自由基是O2，它存在于几乎所有需氧细胞中，是还原剂的反应。此外，LAP可能具有吸附和固定微生物的能力，从而增强抗菌活性。这种活性归因于其结构和抗菌作用模式以及指示微生物细胞壁结构的差异。抗菌活性结果总结起来，可能是由于ROS诱导的细菌膜损伤，导致其完整性不稳定，引起离子流入和细菌死亡。细胞质中钙积累（Ca2+）增加导致线粒体电子传递链激活和ROS生成。线粒体生产三磷酸腺苷（ATP）和水导致低氧浓度，进而引起ROS产生的早期阶段。
作为LAP的结构组分，锂（Li+）在维持合成粘土高度有序的层状（皂石）结构方面起着至关重要的作用，这直接促进了其可控的氧气生成和抗菌能力。这种矿物学稳定性使LAP能够形成触变凝胶，无论温度变化或亲水降解如何，都能保持物理稳健性，这与有机聚合物在分解时指数释放氧气不同。Li+稳定的框架规定了一个特定的阳离子交换容量，作为治疗剂（如CPO）的调节“负载容量”。当CPO保持在此限制内时，如5%配方所见，LAP基质作为有效的氧气屏障，调节孔隙率，提供优异且持续的氧气释放曲线（例如，5小时后2.47 ± 0.01%）。此外，粘土固有的离子结构通过提供热绝缘和物理吸附和固定微生物的能力来增强抗菌活性。这种结构效应与CPO产生的ROS协同作用，裂解细菌膜，创建针对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌病原体的强大、不可渗透的屏障。
4. 结论
本研究的结果表明，纳米合成皂石粘土（LAP）的矿物学特性是其作为生物活性伤口敷料性能的基础。LAP的高度有序层状结构和各向异性形态使其能够形成具有高比表面的触变性水凝胶，作为可控氧气递送的稳定基质。氧气释放动力学受LAP基质的封装效率支配；当CPO含量保持在粘土的负载容量内时，可实现优异的持续释放曲线。与传统聚合物不同，LAP无论温度如何都能保持其凝胶完整性，既作为有效的氧气屏障，又作为长期药物释放的支架。CPO产生的ROS与LAP结构吸附微生物的固有能力相结合，显著提高了针对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌病原体的抗菌屏障性能。这些结果表明，LAP矿物学参数与CPO诱导的氧合之间的协同关系为慢性皮肤伤口的治疗提供了一种低成本、有效且复杂的工具。
