在包括阿根廷在内的许多农业地区，集约化作物生产严重依赖农用化学品来控制害虫和疾病（Ferraro等人，2020年）。杀菌剂尤其令人担忧，因为它们被广泛使用，并经常通过径流和渗漏进入地表水，从而影响非目标生物（Riaz等人，2021年）。在三唑类杀菌剂中，由于其高效对抗多种真菌病原体，这类杀菌剂在现代农业中被广泛使用（Song等人，2024年）。戊唑醇是最常用的三唑类杀菌剂之一，它通过抑制真菌中的甾醇生物合成、破坏膜完整性并导致真菌细胞死亡来发挥作用。虽然戊唑醇在作物保护方面有效，但其环境持久性和移动性相对较高，水-土壤半衰期为60–200天，迁移性中等（Koc约为800–1200），增加了水生生物接触的风险（Zhang等人，2015年）。环境监测显示，溪流中的戊唑醇浓度范围为0.32–6.50微克/升（Rabiet等人，2010年），在径流事件期间浓度可超过500微克/升（Potter等人，2014年）。先前的研究已经报告了戊唑醇对鱼类、两栖动物和无脊椎动物的不良影响，包括氧化应激、内分泌紊乱和发育毒性（Altenhofen等人，2017年；Li等人，2020年；Pérez-Rodriguez等人，2019年；Poulsen等人，2015年；Tofan等人，2023年）。然而，监管框架通常依赖于有限的毒理学指标，如死亡率或生长抑制，这可能低估了与生态系统健康相关的全部亚致死效应。
受水污染影响最严重的生物之一是两栖动物，因为它们的皮肤具有渗透性，且早期生活阶段完全在水生环境中度过。它们的敏感性以及全球种群数量的持续下降，突显了了解特定农用化学品（如戊唑醇）如何影响其生理和生存的必要性（Awkerman等人，2024年；Dong，2024年；Green等人，2020年）。
Rhinella arenarum是一种原产于南美的两栖动物，已被广泛用于标准化生态毒理学实验中，如AMPHITOX协议（Pérez Coll等人，2017年）。我们之前利用R. arenarum的早期发育阶段证明了这种杀菌剂的致死和亚致死效应（Acquaroni等人，2024年），结果表明戊唑醇可能导致多种形态和行为变化，以及该物种变态过程的紊乱。尽管已经评估了戊唑醇对两栖动物的毒性，但大多数研究仅依赖于单一指标（例如致死性、形态学），很少有研究整合多个生物标志物水平（Altenhofen等人，2017年；Warsneski等人，2024年）。
因此，本研究的目的是评估一种基于戊唑醇的商业杀菌剂对R. arenarum幼体的急性和亚致死毒性。为了评估氧化失衡，我们量化了关键的抗氧化防御机制（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽S-转移酶以及谷胱甘肽含量），这些机制能快速响应氧化挑战。通过丁酰胆碱酯酶的活性来评估神经毒性，这是一种对胆碱酯酶抑制剂敏感的指标。通过微核频率来评估基因毒性损伤，这是染色体不稳定性的一个可靠指标。此外，为了将这些机制性反应整合为一个全面的生理压力测量值，我们应用了综合生物标志物反应（IBR）指数，该指数将多个指标综合为一个定量值，越来越多地用于解释不同类群的亚致死毒性效应（Sanchez等人，2013年）。通过将单个生物标志物反应与IBR结合，本研究有助于阐明这种杀菌剂的毒性机制，从而为生态风险评估和脆弱两栖动物种群的保护提供相关信息。我们假设亚致死剂量的戊唑醇暴露会破坏氧化还原平衡，抑制胆碱酯酶活性，并增加基因毒性损伤，从而导致IBR评分升高。
研究物种
成年R. arenarum蟾蜍从阿根廷布宜诺斯艾利斯省的一个未受污染地点采集。驯化、繁殖和胚胎处理遵循AMPHITOX协议中规定的程序（Pérez Coll等人，2017年）。使用5000国际单位的人绒毛膜促性腺激素（hCG）诱导雌性排卵。卵子使用稀释在1毫升AMPHITOX溶液（AS；NaCl 36毫克/升，KCl 0.5毫克/升，CaCl₂ 1毫克/升，NaHCO₃ 2毫克/升）中的睾丸悬浮液进行受精。胚胎随后被培养。
氧化应激生物标志物
在接触基于戊唑醇的制剂96小时后，R. arenarum幼体的氧化应激参数发生了显著变化（图1）。与对照组相比，所有处理组的CAT活性降低了22–23%，而GST活性降低了21–30%。GSH水平显示出浓度依赖性的下降，在0.005、0.01和0.05毫克/升浓度下分别降低了28%、59%和56%。相比之下，0.05毫克/升浓度下的SOD活性增加了24%。
讨论
本研究表明，环境实际浓度下的戊唑醇对R. arenarum幼体具有显著的亚致死效应。即使在远低于我们之前研究中确定的致死浓度NOEC值的浓度下，暴露的幼体也表现出生化、生理和基因毒性变化。这些发现提示，在自然栖息地中，类似的暴露可能对种群生存构成潜在风险。
结论
本研究表明，环境相关浓度的戊唑醇暴露会导致Rhinella arenarum幼体出现明显的亚致死效应，包括氧化失衡、BChE活性抑制和微核频率增加。通过IBR指数整合这些反应，揭示了明显的浓度依赖性生物压力模式。本研究仅限于急性亚致死暴露，因为该物种的行为和慢性效应尚未得到研究。
CRediT作者贡献声明
克里斯蒂娜·佩雷斯·科尔（Cristina Pérez Coll）：可视化、验证、资源管理、概念构思。梅赛德斯·阿夸罗尼（Mercedes Acquaroni）：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析。加布里埃拉·斯瓦茨（Gabriela Svartz）：撰写修订稿、编辑、撰写初稿、可视化、验证、资源管理、方法学设计、实验研究、资金申请、数据分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了阿根廷科学技术部（Ministerio de Ciencia y Tecnología）的资助，项目编号为PICT 00921-2018。加布里埃拉·斯瓦茨（Gabriela Svartz）和克里斯蒂娜·佩雷斯·科尔（Cristina Pérez Coll）是阿根廷国家科学技术研究委员会（CONICET）的科学家。梅赛德斯·阿夸罗尼（Mercedes Acquaroni）获得了CONICET的奖学金。我们感谢亚历杭德罗·穆诺兹（Alejandro Munoz）博士对样品的化学分析。
