ZnMOF的合成与表征
研究团队成功合成了一种结构稳健的锌基金属有机框架（ZnMOF）。其配体4,4′-二(1H-吡唑-4-基)-1,1′-联苯（H2 L）通过铃木偶联反应制备，产率高达79%。ZnMOF纳米颗粒通过H2 L与六水合硝酸锌（Zn(NO3 )2 ·6H2 O）在80°C下溶剂热反应获得。粉末X射线衍射（PXRD）分析表明，ZnMOF结晶于单斜晶系Pc空间群，其结构模型经过几何优化和Pawley精修后，与实验数据高度吻合（Rwp = 2.69%, Rp = 2.07%）。在该框架中，Zn2+ 与吡唑阴离子配位形成棒状次级结构单元，进一步通过L配体连接成三维cds（CdSO4 ）拓扑网络。
透射电子显微镜（TEM）显示ZnMOF呈均匀的纳米片状形态，横向尺寸为100-200纳米，厚度小于50纳米，有利于生物相互作用和细胞摄取。动态光散射（DLS）测得ZnMOF在水中的流体动力学尺寸为180.8 ± 26.4纳米，与广泛应用的ZIF-8（169.8 ± 4.7纳米）相当。氮气吸附-脱附等温线在77 K下显示为I型吸附曲线，Brunauer-Emmett-Teller（BET）比表面积为451.5 m2 /g。孔径分布分析显示两个主要孔径，分别集中在12.5和25 Å，总孔体积为0.219 cm3 /g。尽管其比表面积和孔体积低于ZIF-8（BET: 1371.9 m2 /g），但ZnMOF拥有更大的孔径，有利于大分子化疗药物（如阿霉素，DOX）的封装。
最关键的优势在于其卓越的生理稳定性。在磷酸盐缓冲盐水（PBS, pH 7.4）中浸泡20天后，ZnMOF仍能保持其晶体结构，而ZIF-8在3天内几乎完全降解，转化为不溶性的磷酸锌盐。ZnMOF在各种生物相关介质（水、PBS、0.1×PBS、含10%胎牛血清的DMEM）中也表现出优异的胶体稳定性，而ZIF-8则出现严重聚集。DOX负载实验表明，ZnMOF和ZIF-8的负载率分别为13.0 mol%和17.4 mol%（基于Zn含量）。载药后，DOX@ZnMOF粒径适度增加至324.6 ± 114.6纳米，而DOX@ZIF-8则因严重聚集粒径增至1573 ± 194.0纳米。药物释放动力学研究显示，在酸性条件（pH 5.5）下，两者均能加速释放DOX（8小时内释放约41.8%-49.6%），但在生理条件（PBS, pH 7.4）下，DOX@ZnMOF的释放更缓慢、更可控，24小时内释放约40%，远低于DOX@ZIF-8的快速释放（8小时内约70%），有效减少了药物的提前泄漏。
细胞摄取与线粒体靶向
细胞毒性评估显示，ZnMOF本身在低于50 µM的浓度下对CT26和4T1细胞毒性微弱（IC50 分别为116.2 µM和390.3 µM）。Zeta电位分析揭示，在酸性pH下，载有DOX的ZnMOF和ZIF-8表面电荷由负转正，这有助于其与带负电的细胞膜静电相互作用，促进细胞摄取。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析证实，ZnMOF处理的CT26细胞在24小时后细胞内Zn2+ 积累超过6 µM，显著高于ZIF-8处理组（< 2 µM），表明ZnMOF具有更高效的细胞内存作用。
利用TSQ荧光探针检测细胞内游离Zn2+ 的动态释放。处理4小时后立即染色，ZIF-8组TSQ信号最强（~2.76），ZnMOF组为~2.25，Zn(NO3 )2 组为~2.39（PBS组归一化为1）。然而，在更换新鲜培养基继续培养24小时后再染色，ZnMOF组的TSQ信号显著增强至~3.80，而ZIF-8和Zn(NO3 )2 组信号变化不大。这证明了ZnMOF能够实现持续且延时的Zn2+ 释放，这对于长期效应至关重要。
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像清晰展示了DOX@ZnMOF卓越的线粒体靶向能力。游离DOX在细胞质中弥散分布，与线粒体共定位程度低（皮尔逊相关系数PCC: 0.13）。DOX@ZIF-8显示出增强的胞质DOX积累和中等线粒体共定位（PCC: 0.43）。而DOX@ZnMOF则表现出与线粒体的强烈共定位（PCC: 0.75），这归因于其正表面电荷、较小粒径以及优异的胶体和结构稳定性，共同促进了线粒体膜电位驱动的摄取。增强的线粒体DOX积累有望加剧线粒体ROS产生和氧化损伤。流式细胞术进一步定量证实，DOX@ZnMOF处理细胞的DOX中位荧光强度（MFI）是游离DOX的1.67倍，表明其具有更优越的细胞摄取和递送效率。
氧化应激与铁死亡性细胞死亡
研究深入探讨了ZnMOF诱导铁死亡的分子机制。谷胱甘肽（GSH）是细胞内主要的抗氧化剂。与PBS对照组相比，ZnMOF处理能显著耗竭细胞内GSH（降至0.52 µM，降低约72%）和总谷胱甘肽（降至1.77 µM，降低约72%）。相比之下，ZIF-8仅中度降低总谷胱甘肽（3.80 µM），而游离Zn2+ （Zn(NO3 )2 ）甚至意外地提高了GSH水平（3.93 µM），这可能是一种代偿性抗氧化反应。游离DOX也能显著耗竭总谷胱甘肽（2.53 µM）。然而，DOX@ZnMOF产生了最强的协同效应，将GSH降至0.37 µM（降低约80.1%），总谷胱甘肽降至1.33 µM（降低约80%）。这表明ZnMOF持续的Zn2+ 释放通过破坏谷胱甘肽的生物合成和再生，加剧了氧化应激。
铁死亡的关键标志是脂质过氧化。使用Liperfluo探针检测脂质ROS发现，ZnMOF处理使脂质过氧化水平增加约1.9倍，而ZIF-8仅增加约1.3倍。加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）可部分逆转ZnMOF的效应，证明其脂质ROS积累至少部分依赖于铁死亡通路。
谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是修复脂质过氧化的关键酶。蛋白质印迹（Western Blot）分析显示，DOX@ZnMOF处理导致GPX4表达量急剧下降94.9%，远高于ZnMOF单独处理（57%下降）、游离Zn2+ （64.9%下降）、游离DOX（63.3%下降）和DOX@ZIF-8（36.3%下降）的效果。值得注意的是，游离Zn2+ 能在不明显影响总谷胱甘肽的情况下显著下调GPX4，提示其可能直接破坏GPX4稳定性，这与ZnMOF框架内持续释放Zn2+ 的机制有所不同且可能产生协同。
细胞内总ROS水平检测（DCFH-DA探针）表明，ZnMOF和DOX@ZnMOF处理能分别引起4.24倍和8.55倍的ROS增加（相对于PBS）。这种显著的ROS爆发， combined with GSH耗竭和GPX4下调，共同营造了一个强大的促氧化环境，驱动铁死亡性细胞死亡。
体外抗癌效果
DOX@ZnMOF展现出强大的基因毒性和细胞周期干扰能力。γ-H2AX（DNA双链断裂标志物）免疫荧光显示，DOX@ZnMOF处理引起的信号强度是游离DOX的2.23倍，而DOX@ZIF-8仅为1.23倍，这与高ROS水平导致的DNA损伤相符。细胞周期分析揭示，DOX@ZnMOF引起显著的G2/M期阻滞（阻滞细胞比例达90.9%），远高于DOX@ZIF-8组（50.1%），表明DNA损伤应答通路被强烈激活。
细胞活力（MTS）实验评估了长期疗效。在72小时，高剂量（100 µM ZnMOF / 13 µM DOX）的DOX@ZnMOF将细胞活力降至2.5%，显著优于DOX@ZIF-8（18.7%）和游离DOX（9.9%）。在中等剂量（50 µM ZnMOF / 6.5 µM DOX）下，DOX@ZnMOF仍能将活力降至2.9%，而DOX@ZIF-8则为32.9%。这凸显了DOX@ZnMOF卓越的长期细胞毒性，得益于其持续的Zn2+ 和DOX释放以及有效的铁死亡诱导。相应地，DOX@ZnMOF诱导的细胞凋亡率也最高（48.47%），显著高于其他处理组。
体内抗肿瘤功效
在CT26和MC38结肠癌小鼠模型中，通过瘤内注射评估了DOX@ZnMOF的疗效。DOX@ZnMOF在两个模型中均表现出最强的肿瘤生长抑制能力，肿瘤生长抑制指数（TGI）分别达到0.91（CT26）和0.93（MC38），显著高于游离DOX（TGI: 0.70和0.76）和DOX@ZIF-8（TGI: 0.48和0.56）。DOX@ZnMOF治疗还大幅延长了小鼠的中位生存期（CT26模型：42天 vs 游离DOX 31天；MC38模型：>50天，60%存活 vs 游离DOX 41天）。所有治疗组小鼠体重稳定，未观察到系统性毒性迹象。
组织学分析为疗效机制提供了直接证据。苏木精-伊红（H&E）染色显示DOX@ZnMOF组肿瘤组织出现广泛坏死。免疫组织化学（IHC）染色证实，DOX@ZnMOF组肿瘤中GPX4表达下调最显著（信号强度比PBS组低约32.5倍），强烈支持铁死亡的发生。γ-H2AX染色显示DOX@ZnMOF组DNA损伤最严重。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示DOX@ZnMOF组凋亡细胞比例最高（~82.5%）。对主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色以及血清生化指标（AST, ALT, BUN）检测均未发现明显病理改变或毒性，溶血实验也表明ZnMOF生物相容性良好。
结论
本研究成功开发了一种新型ZnMOF纳米平台，其整合了高效的DOX递送与Zn2+ 介导的铁死亡诱导双重功能。与ZIF-8相比，ZnMOF具有显著增强的生理稳定性和可控释放特性。它通过持续释放Zn2+ ，有效耗竭GSH、下调GPX4、升高ROS、诱导脂质过氧化，并与DOX协同引发DNA损伤和细胞周期阻滞，最终导致铁死亡和凋亡协同的细胞死亡。在两种结肠癌模型中，DOX@ZnMOF表现出卓越的肿瘤抑制效果和生存益处，且安全性良好。该研究为利用金属离子诱导铁死亡以增强化疗效果、克服耐药性提供了新的思路和有效的纳米工具。
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