通过传统技术检测血液生物标志物面临诸多挑战，主要原因是这些标志物的含量极低、生物流体成分复杂以及其高度糖基化。生物标志物在血液中的浓度通常非常低，通常在每毫升皮克或纳克级别。[1] 它们与脂质和/或脂蛋白形成复合物，而这些复合物由胆固醇酯和甘油三酯为核心，周围包裹着游离胆固醇、磷脂和载脂蛋白，这使得检测变得困难。[2] 生物标志物的糖基化状态可能影响其识别能力，并促进蛋白质-脂质相互作用的形成。[3] 在癌症生物标志物的常规临床检测中这一点尤为重要，因为这些检测通常不需要患者禁食。脂质和脂蛋白的含量会随饮食变化，已有研究表明生物标志物可能嵌入脂质颗粒（如HDL和LDL颗粒）中，[3] 从而使得通过酶联免疫吸附测定（ELISA）等传统方法无法检测到它们。[3]
先前的研究表明，如CLA-1、[4] CD36、[5] [6] 和丙型肝炎病毒糖蛋白E2[7] [8] 等糖基化蛋白质能与脂蛋白相互作用。最近的一项研究首次证明了糖基化生物标志物可溶性血管内皮钙黏蛋白（sVE）与HDL颗粒的直接相互作用，表明蛋白质-脂质相互作用会影响生物标志物的检测结果。[3] 然而，这些相互作用的纳米结构机制仍不甚清楚，尤其是对于特定的癌症生物标志物而言。了解蛋白质-脂质相互作用不仅有助于推进基础科学研究，还能优化用于检测血液样本中蛋白质生物标志物的生物传感技术的灵敏度和可靠性，尤其是当这些蛋白质发生糖基化、难以用现有方法检测时。此外，脂质还具有开发创新分析方法和生物传感技术的潜力。[9] [10] [11]
在本研究中，我们重点关注甲胎蛋白（AFP），这是一种与肝癌发展相关的糖基化生物标志物。AFP是一种69 kDa的N-连接糖蛋白，存在于胎儿血清中，但在成人中的含量迅速下降，通常降至5-10 ng/mL的范围。[12] [13] [14] 相反，在肝细胞癌（HCC）和其他肝脏疾病中，AFP浓度会升高，其检测结果可以预示肿瘤的复发。研究表明，AFP浓度超过400 ng/mL通常可作为HCC高风险患者的诊断指标，[14] 或与HCC多种治疗的不良预后相关。[15] 然而，AFP的灵敏度和特异性较低，[16] 而低于100 ng/mL的浓度特异性较差，因为慢性肝炎患者也可能出现类似的AFP水平。[17] 尽管如此，AFP仍被视为HCC的肿瘤相关生物标志物。
在本研究中，我们研究了糖基化生物标志物AFP与模型细胞膜之间的纳米结构相互作用，特别关注不同脂质组成对这种相互作用的影响。结构表征采用了中子反射谱（NR）和带耗散监测的石英晶体微天平（QCM-D）技术对平面脂质双层进行测量。为了建立AFP-膜相互作用的参考标准，我们将AFP的行为与牛血清白蛋白（BSA）进行了比较，后者因其结构与人类血清白蛋白（HSA）相似且易于商业购买而被选为模型蛋白。
BSA的分子量约为66.5 kDa，由583个氨基酸组成，分为三个同源结构域，整体呈椭圆形。其理论等电点（pI）为5.6，在生理pH值下带有净负电荷。BSA的溶液性质已得到充分研究，其单体回转半径为27.6 Å。[18] 尽管传统上认为白蛋白（包括BSA）是非糖基化的，但最新证据表明在某些非典型位点可能存在低水平的糖基化。[19] 此外，BSA含有易发生糖基化的残基，如赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸[20]，并且具有多个脂肪酸（FA）结合位点。虽然BSA能与亲脂化合物结合，但它与两性离子型脂质双层的相互作用通常较弱，不过这种相互作用可能因具体脂质组成而异。[21] [22] [23]
AFP在结构上与白蛋白相似，含有约585个氨基酸残基，分为三个同源结构域。C端的第三结构域最为保守，而N端的第一个结构域结构变化较大。[24] [25] AFP呈现不对称的心形构象，尺寸为93.2 Å × 83.3 Å × 59.6 Å，具有四个天然的FA结合位点，并在N251位点发生N-糖基化。[25] 结合电子密度图和LC-MS/MS的结构研究表明其糖链组成，包括N251S突变体。[25] AFP的外表面主要是亲水性的，有利于其在血液中的溶解；FA结合位点由疏水残基构成，并两侧有带正电荷的侧链，尤其是精氨酸和赖氨酸。[26] [27] 与BSA类似，AFP的理论等电点（pI）为5.48，在生理pH值下带有净负电荷。鉴于AFP与BSA的尺寸和形状相似，我们假设其回转半径也相近。
为了解释实验结果，我们进行了AFP和BSA与计算机生成的脂质双层相互作用的完全原子级分子动力学（MD）模拟，模拟总时间为40微秒。这些模拟提供了蛋白质-脂质相互作用的原子级信息，以及脂质组成如何影响这些相互作用，从而加深了我们对这些相互作用及其潜在结构影响的理解。
这一策略使我们能够系统地探讨不同的生物物理性质如何影响蛋白质-脂质相互作用。此外，实验结果和MD模拟有助于我们更好地理解生物标志物与脂质成分之间的相互作用机制，揭示了可能用于生物传感应用的特定或非特异性相互作用。
